转CBF3基因茄子后代植株抗寒性与分子检测研究

摘要

茄子(Solanum melongena L.)是喜温蔬菜，22-30℃是茄子生长的最佳温度，在冬季和春季温度较低时经常会遇到冷害，导致生长发育迟缓，产量品质降低。冷害发生在0-10℃的低温，会阻碍植物正常的生理活动。所受低温的温度和低温持续时间共同决定植物受伤害的程度。由于秋延晚和冬春反季节果菜栽培的经济效益显著，反季节栽培发展迅速，显得抗寒品种尤为重要。我国抗寒能力强的茄子优良品种不多，从国外引进的抗寒品种种子价格高，抗寒性有限，且不适合消费习惯。各国学者对番茄和辣椒的抗冷性研究较多，但对茄子的研究较少。
　　拟南芥CBF1是冷应答基因COR(cold regulated)的转录激活因子，它是通过基因工程提高植物抗寒性的一条重要的新途径。该类转录因子能与下游COR抗寒基因启动子上的CRT/DRE特异性结合，增进下游基因的表达，激发植物内的多种耐逆机制，从而提高转基因植株耐低温、干旱和高盐等各种非生物胁迫的能力。在此基础上，很多学者进行了拟南芥CBF1(AtCBF1)基因转化研究，而且都获得了理想的抗性转基因材料，为植物的抗低温、干旱和高盐等研究提供了理论依据。
　　本试验是在成功获得转AtCBF3基因茄子植株的基础上，对通过套袋自交获得的转基因T2代茄子种子进行种植并做抗寒性研究，旨在探讨外源基因AtCBF3在T2代转基因植株后代中是否表达及在抗寒特性上的差异，为转基因茄子抗寒新品种的培育和研究提供理论依据。
　　以得到的转基因茄子的4个株系B4、B27、A16、A27的后代（T2代）及其野生型对照CK为试验材料，主要进行以下研究:
　　(1)对T2代的转基因株系进行PCR检测，探讨外源基因是否成功转入茄子并对转基因植株进行RT-PCR基因表达分析;
　　(2)将PCR检测呈阳性的转基因植株和野生型对照CK放在低温下进行处理后测定其相对电导率、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、脯氨酸等与抗寒性相关的生理生化指标;
　　(3)对转基因植株和对照进行低温处理，从植株受冷害情况直接鉴定耐寒性。
　　得到了以下结论:
　　1.对T2代的转基因植株B4、B27、A16、A27及野生型对照CK进行PCR和RT-PCR检测，结果是AtCBF3基因成功转入B4和A27的基因组且成功表达，低温处理时间不同外源基因表达情况也有差异;
　　2.在4℃低温处理下，测定了与质膜稳定性相关的指标，转基因植株的相对电导率和MDA要低于野生型对照，而清除活性氧的CAT活性转基因植株要高于野生型对照，这些结果表明质膜的稳定中AtCBF3基因起到了至关重要的作用;
　　3.在4℃低温处理下，对细胞中渗透调节物质的含量进行了测量研究，转基因植株的可溶性蛋白含量、可溶性糖、脯氨酸均高于野生型对照，结果显示AtCBF3基因的表达有利于维持细胞的渗透压;
　　4.在4℃低温处理下，对转基因茄子及其野生型对照进行了抗寒性检测，转基因植株的受冷害程度与野生型对照相比明显较轻，清晰的表明了基因的过量表达是转基因茄子的抗寒性提高的直接因素;
　　5.用隶属函数法对各项生理生化指标进行综合性分析，转基因株系A27、B4和野生型对照CK的抗寒性强弱顺序为B4＞A27＞CK。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 文献综述

1．1 植物的抗寒研究进展

1．1．1 植物低温伤害的类型

1．1．2 低温引起植物损伤的主要原因

1．2 植物的抗寒生理生化研究

1．3 植物的抗寒生物技术研究现状

1．3．1 植物抗寒基因研究现状

1．3．2 植物其它抗性基因研究现状

1．3．3 茄子遗传转化研究现状

1．4 存在的问题与展望

第2章 引言

2．1 研究目的和意义

2．2 研究的主要内容

2．3 拟解决的关键问题

2．4 预期结果

第3章 试验材料与方法

3．1 供试材料的培养与处理

3．2 试验所用药品和器材

3．2．1 转基因植株的PCR鉴定和基因表达的RT-PCR分析

3．2．2 相对电导率的测定

3．2．3 可溶性糖含量的测定

3．2．4 可溶性蛋白含量的测定

3．2．5 CAT活性的测定

3．2．6 脯氨酸含量的测定

3．2．7 MDA含量的测定

3．2．8 转基因及对照植株耐寒性鉴定

3．3 试验方法

3．3．1 转基因植株的PCR鉴定和基因表达的RT-PCR分析

3．3．2 相对电导率的测定

3．3．3 可溶性糖含量的测定

3．3．4 可溶性蛋白含量的测定

3．3．5 CAT活性的测定

3．3．6 脯氨酸含量的测定

3．3．7 MDA含量的测定

3．3．8 转基因植株的耐寒性鉴定

3．3．9 茄子抗寒性综合分析

3．4 试验数据处理

第4章 结果与分析

4．1 转基因植株的PCR鉴定和AtCBF3基因在转基因茄子中的表达

4．2 相对电导率的测定结果

4．3 可溶性糖含量的变化

4．4 可溶性蛋白含量的变化

4．5 CAT活性的测定结果

4．6 脯氨酸含量的变化

4．7 MDA含量的测定结果

4．8 转基因植株的耐寒性鉴定结果

4．9 茄子抗寒性综合分析

第5章 讨论与结论

5．1 转基因植株的PCR鉴定和基因表达的RT-PCR分析

5．2 生理生化指标与抗寒性的关系

5．3 转基因茄子的抗冷性检测

5．4 茄子抗寒性综合分析

结论

参考文献

缩略词对照表

致谢

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