芥菜开花整合子AGL24与SVP、FLC、SOC1互作分析及作用位点的鉴定

摘要

芥菜开花时间的调控是一个复杂精细的过程，需要整合环境信号以及植物体内信号，在适宜的环境以及生理条件下才可以进行开花转换，植物进而可以由营养生长转向生殖生长。MADS-box转录因子在这个开花过程发挥的作用至关重要，并且在开花调控网络中占据着许多关键性的位置。其中FLC和SVP作为开花抑制因子，而SOC1和AGL24能够促进开花。AGL24、SOC1、SVP、FLC编码的蛋白均属于MIKC型蛋白，在调控开花网络中它们是通过蛋白互作来行使其功能的。而蛋白之间的相互作用对蛋白本身的功能以及它们所调控的生物进程也至关重要。芥菜中大多数的MADS结构域蛋白间的相互作用都保守，截止目前，有关SVP、SOC1、FLC的功能和作用机制已有较多研究，但是AGL24的分子机制鲜有报道。为了研究AGL24与这些同类蛋白在植物体内是否产生相互作用，并筛选出蛋白互作的关键氨基酸位点，本实验利用了酵母双杂交系统和双分子荧光互补技术。研究AGL24蛋白与其他蛋白之间的相互作用，可以进一步的揭示分子调控网络中潜在的功能联系，同时也为生物体内的生物进程在分子水平上作进一步的解释。
　　主要试验结果如下:
　　1.芥菜AGL24基因亚克隆及生物信息学分析
　　以芥菜茎尖总RNA反转录cDNA第一链为模板，扩增得到的AGL24基因的cDNA序列为666 bp，编码221个氨基酸残基，属于MIKC型蛋白，与油菜的AGL24亲缘关系最近，与毛白杨的相对最远。AGL24蛋白主要呈现亲水性，其二级结构预测分析表明芥菜AGL24蛋白α螺旋占50％，且主要集中在K域，β折叠和卷曲螺旋分别占12％和38％。本试验预测得到了AGL24蛋白的三维结构图。
　　2.芥菜AGL24与SVP、FLC相互作用检测
　　构建酵母诱饵表达载体pGADT7-AGL24以及AGL24去M域的重组质粒pGADT7-AGL24M，通过醋酸锂转化法将重组质粒转化到感受态酵母中得到酵母转化子Y187(pGBKT7-AGL24)和Y187(pGBKT7-AGL24M)，经过毒性及自激活检测，发现无自激活和毒性现象。将Y187(pGBKT7-AGL24)和Y187(pGBKT7-AGL24M)分别与本实验室提供的 Y2HGold(pGBKT7-SVP)、 Y2HGold(pGBKT7-SVP)融合后，二倍体酵母Y187(pGADT7-AGL24)×Y2HGold(pGBKT7-SVP)、 Y187(pGADT7-AGL24M)×Y2HGold(pGBKT7-SVP)、Y187(pGADT7-AGL24)×Y2HGold(pGBKT7-FLC)、Y187(pGADT7-AGL24M)×Y2HGold(pGBKT7-FLC)均不能在选择型培养基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA(QDO/X/A)平板上生长。
　　将AGL24及AGL24去M域截短体与BiFC中的C端载体（pSPYCE-35S）重组构建重组质粒YCEG和YCEGM，将SVP和FLC分别与BiFC的N端载体（pSPYNE-35S）重组构建重组质粒YNES和YNEF，通过冷热刺激法转化农杆菌GV3101。将含YCEG和YCEGM的农杆菌分别与含YNES和YNEF的农杆菌菌液等量混合共浸润4～6片真叶的本氏烟，48 h后通过激光共聚焦显微镜在488 nm激发光下观察，发现YCEG×YNES、YCEG×YNEF、 YCEGM×YNES、YCEGM×YNEF在本氏烟草表皮细胞上无黄色荧光发出。说明了开花信号整合子AGL24及AGL24去M域截短体与开花负调控因子SVP、FLC均没有产生蛋白相互作用。
　　3.芥菜AGL24与SOC1相互作用检测
　　将Y187(pGADT7-AGL24)、Y187(pGADT7-AGL24M)分别与Y2HGold(pGBKT7-SOC1)、Y2HGold(pGBKT7-SOC1M)融合后，二倍体酵母Y187(pGADT7-AGL24)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)、Y187(pGADT7-AGL24M)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1M)均能在选择型培养基SD/-Leu/-Trp/AbA(DD O/A)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)平板上长白色菌落、并能在QDO/X/A平板上生长呈现蓝色菌斑，而二倍体酵母Y187(pGADT7-AGL24M)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)、Y187(pGADT7-AGL24)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1 M)经多次鉴定表明不能在DDO/A、QDO、QDO/X/A上生长。
　　利用Thermo公司Yeastβ-Galactosidase Assay Kit试剂盒测定杂交组合pGADT7-AGL24×pGBKT7-SOC1和pGADT7-AGL24M×pGBKT7-SOC1M的β-半乳糖苷酶活性来分析蛋白作用强度。发现全长蛋白AGL24与SOC1互作的平均酶活性(5.05 Miller Units)显著低于截短体AGL24M与SOC1M之间的活性(8.24 Miller Units)，说明芥菜AGL24和SOC1蛋白的M域对蛋白互作具有一定抑制作用。
　　将SOC1及SOC1去M域截短体与BiFC的N端载体(pSPYNE-35S)重组构建重组质粒YNEO和YNEOM。将含YCEG和YCEGM的农杆菌分别与含YNEO和YNEOM的农杆菌菌液等量混合共浸润4～6片真叶的本氏烟，48 h后通过激光共聚焦显微镜在488 nm激发光下观察发现，共浸润含YCEG和YNEO、YCEGM和YNEOM的本氏烟草表皮细胞发出黄色荧光，而共浸润含YCEGM和YNEO、YCEG和YNEOM的本氏烟草表皮细胞不发光。综上说明，开花信号整合子AGL24与SOC1及其两蛋白均去掉M域的截短体存在相互作用，但两蛋白中有且仅有其中一蛋白M域存在的情况下没有蛋白互作。
　　4.芥菜AGL24突变体的构建及其与SOC1作用位点的筛选
　　在AGL24蛋白的K域预测了三个关键氨基酸残基位点，并分别构建AGL24Q107L、AGL24R137L、AGL24E169L3个AGL24突变体，并构建 pGADT7-AGL24Q107L、pGADT7-AGL24R137L，pGADT7-AGL24E169L突变体酵母表达载体。通过醋酸锂转化法将重组质粒转化到感受态酵母中得到酵母转化子Y187的Y187（pGADT7-AGL24Q107L）、Y187(pGADT7-AGL24R137L)和Y187(pGADT7-AGL24E169L)。经过毒性及自激活检测，发现均无自激活和毒性现象。分别将这3个突变体的酵母转化子与Y2HGold(pGBKT7-SOC1)融合，发现二倍体酵母Y187(pGADT7-AGL24R137L)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)、Y187(pGADT7-AGL24E169L)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)能在选择型培养基QDO/X/A平板上长蓝色菌落，而Y187(pGADT7-AGL24 Q107L)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)不能生长。
　　酵母β-半乳糖苷酶活性分析表明:在与SOC1蛋白相互作用中，第137和169位点的AGL24突变体（AGL24R137L和AGL24E169L）与与非突变体AGL24差异不显著，它们的酶活分别为3.11，3.70和4.44，说明第137和169位点不是调节SOC1与AGL24之间作用强度的关键位点。
　　将AGL24三个突变体与BiFC中的C端载体(pSPYCE-35S)重组构建重组质粒YCEGQ107L、YCEGR137L、YCEGE169，与SOC1连BiFC的N端载体(pSPYNE-35S)构建重组质粒YNEO，通过冷热刺激法转化农杆菌GV3101。将分别含YCEG Q107L、YCEGR137L、YCEGE169的农杆菌与含YNEO的农杆菌菌液等量混合共浸润4～6片真叶的本氏烟，48 h后通过激光共聚焦显微镜在488 nm激发光下观察，发现混合组合YCEGR137L×YNEO、YCEGE169L×YNEO有黄色荧光产生，混合组合YCEGQ107L×YNEO没有荧光发出。综上说明，开花信号整合子AGL24的第137位和169位氨基酸突变后对蛋白相互作用没有产生明显的抑制作用，而第107位氨基酸突变后抑制了AGL24与SOC1蛋白的互作，说明第107位氨基酸时参与蛋白互作的关键氨基酸。
　　5.芥菜SOC1突变体与AGL24作用位点的筛选
　　通过醋酸锂转化法将本实验室提供的SOC1突变体酵母表达质粒pGBKT7-SOC1 V77K、pGBKT7-SOC1P81K、pGBKT7-SOC1 K108V、pGBKT7-SOC1 R109L以及pGBKT7-SOC1 C137K转化到感受态酵母中得到酵母转化子Y2HGold(pGBKT7-SOC1V77K)，Y2HGold(pGBKT7-SOC1 P81K)，Y2HGold(pGBKT7-SOC1K108V), Y2HGold(pGBKT7-SOC1R109L)以及Y2HGold(pGBKT7-SOC1C137K)。经过毒性及自激活检测，发现均无自激活和毒性现象。分别将这5个突变体的酵母转化子与Y187(pGADT7-AGL24)融合后的二倍体酵母均能在选择型培养基QDO/X/A平板上长蓝色菌落。说明SOC1五个突变体蛋白能够与AGL24蛋白相互作用，并激活报告基因H1S3、AUR1-C、ADE2、MEL1的转录表达。
　　酵母β-半乳糖苷酶活性表明:SOC1C137K突变体与AGL24蛋白的作用强度(酶活性为21.58)显著高于非突变体SOC1（酶活性为4.44）。由此说明SOC1蛋白第137位氨基酸能够调节SOC1/AGL24的聚合强度。另外，SOC1V77K×AGL24、SOC1P81K×AGL24、SOC1K108V×AGL24、SOC1R109L×AGL24杂交组合彼此之间作用强度差异不显著(酶活性分别为3.14、2.73、2.50和3.19)，但是均显著低于SOC1×AGL24杂交组合（酶活性为4.44）.
　　通过冷热刺激法将实验室提供的SOC1突变体的BiFC重组质粒YNEOV77K、YNEOP81K、YNEOK108V、YNEOR109L以及YNEOC137K导入农杆菌GV3101中。确定阳性克隆后，分别将每种菌液与含YCEG的菌液等量混合共浸润4～6片真叶的本氏烟，48 h后通过激光共聚焦显微镜在488 nm激发光下观察发现，共浸润五个组合的本氏烟草表皮细胞上的保卫细胞和鞭毛发黄色荧光，说明它们之间均可相互作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 AGL24花期调控的分子机制

1．2 AGL24对花发育的调控

1．3 芥菜AGL24在春化途径、光周期途径以及自主途径中的表达

1．4 AGL24在开花调控网络中的上位性关系

1．4．1 AGL24与SOC1相互调控

1．4．2 AGL24与SVP功能差异

1．4．3 AGL24受AP1调控

1．4．4 AGL24调控TFL1的表达

1．4．5 AGL24抑制B类、C类花器官基因

1．5 研究蛋白相互作用的方法

1．5．1 酵母双杂交系统

1．5．2 双分子荧光互补技术

第二章 引言

第三章 芥菜开花整合子AGL24与SVP、FLC蛋白互作检测

3．1 材料

3．1．1 菌种及载体

3．1．2 试验试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 试验试剂的配制

3．2．2 PCR产物回收

3．2．3 目的片段的连接及转化

3．2．4 重组质粒的提取

3．2．5 阳性克隆的确定

3．2．6 生物信息学分析

3．2．7 引物设计

3．2．8 酵母感受态细胞的制备

3．2．9 农杆菌(GV3101)感受态细胞的制备

3．2．10 酵母感受态细胞的转化(醋酸锂转化法，LiAc法)

3．2．11 农杆菌转化(冷热刺激法)

3．2．12 芥菜AGL24及AGL24去M域截短体基因序列的特异性扩增

3．2．13 酵母双杂交检测AGL24及其去M域截短体与FLC、SVP蛋白互作

3．2．14 BiFC技术检测AGL24以及其去M域截短体与FLC及SVP蛋白互作

3．3 结果与分析

3．3．1 芥菜AGL24的克隆及其蛋白结构分析

3．3．2 酵母表达载体的构建

3．3．3 毒性与自激活检测

3．3．4 BiFC表达载体的构建

3．3．5 蛋白相互作用鉴定

第四章 芥菜AGL24与SOC1蛋白互作鉴定

4．1 材料

4．2 方法

4．2．1 试验试剂的配制

4．2．2 SOC1及SOC1去M域截短体特异性扩增

4．2．3 SOC1及SOC1去M域截短体酵母重组质粒的构建

4．2．4 SOC1及SOC1去M域截短体BiFC重组质粒的构建

4．2．5 蛋白相互作用的鉴定

4．2．6 蛋白相互作用强度分析

4．3 结果分析

4．3．1 酵母双杂交系统鉴定芥菜AGL24与SOC1蛋白互作

4．3．2 BiFC技术鉴定芥菜AGL24与SOC1蛋白互作

4．3．3 芥菜AGL24与SOC1互作强度分析

第五章 AGL24与SOC1蛋白互作关键氨基酸位点筛选

5．1 材料

5．2 方法

5．2．1 AGL24蛋白互作位点在线预测

5．2．2 基因AGL24突变体的构建

5．2．3 AGL24蛋白突变体重组质粒的构建

5．2．4 酵母双杂交系统鉴定蛋白互作

5．2．5 双分子荧光互补技术(BiFC)鉴定蛋白互作

5．3 结果与分析

5．3．1 基因AGL24突变体的构建

5．3．2 突变体重组质粒的鉴定

5．3．3 AGL24突变体与SOC1蛋白互作

5．3．4 SOC1突变体与AGL24蛋白的互作

第六章 讨论

第七章 结论

7．1 成功克隆了芥菜AGL24基因

7．2 芥菜AGL24与SVP、FLC均不能产生蛋白互作

7．3 芥菜AGL24与SOC1能够相互作用

7．4 获得芥菜AGL24参与蛋白互作的关键氨基酸预测位点

7．5 芥菜AGL24与SOC1互作位点鉴定

7．6 芥菜SOC1与AGL24互作位点的鉴定

参考文献

附录

致谢

项目资助

在校期间发表论文