芥菜开花调控因子FLC、SVP与SOC1基因启动子作用区的筛选与鉴定

摘要

芥菜（Brassica junceaL.）是一种重要的十字花科蔬菜作物，然而目前我们对芥菜花期调控的分子机理的细节知之甚少。现已知在春化途径和自主途径中，FLC起到了重要开花抑制作用，在赤霉素和光周期途径中，SVP也能抑制开花，而位于FLC、SVP下游的SOC1，能够整合来自多条开花途径的调控信号，SOC1的表达受到FLC、SVP蛋白负调控。FLC和SVP蛋白都属于MICK类型的MADS转录因子，它们能够识别特定的CArG-box序列。前期试验已经证明，芥菜中FLC和SVP蛋白能够识别并结合到芥菜SOC1基因启动子（编码区上游一段长度为782bp的DNA片段），发生蛋白质-DNA相互作用。但是，FLC和SVP蛋白究竟结合到SOC1基因启动子哪个区段，仍不清楚。因此本试验在已经清楚FLC、SVP蛋白和SOC1基因启动子之间存在相互作用的基础上，利用酵母单杂交技术研究FLC、SVP蛋白与SOC1基因启动子相互作用的结合区域及其相互作用的特异性，为SOC1基因的表达调控及其开花分子机制的深入研究奠定了基础。本研究主要内容包括：
　　⑴芥菜SOC1启动子的CArG-box分段亚克隆及其与FLC、SVP蛋白互作。获得SOC1启动子的分段片段:SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3，每一个小片段都含有一个CArG-box(CC[A/T]6GG)。然后将三个小片段分别连接到酵母载体质粒pAbAi上构建了酵母重组质粒，再将其分别转入酵母菌株Y1H Gold中获得重组酵母菌Y1H[pAbAi-SOC1△1-3]。筛选抑制酵母菌Y1H[pAbAi-SOC1△1-3]生长的环酯肽抗生素（Aureobasidin A，简称AbA）的最低浓度，得到Y1H[pAbAi-SOC1△1-3]的AbA背景浓度分别为100ng/ml、150ng/ml、100ng/ml。接着转入实验室中已经构建好的能够表达融合FLC、SVP蛋白的重组质粒pGADT7FLC、pGADT7SVP，最终得到重组酵母菌Y1H[SOC1△1-3+FLC]和Y1H[SOC1△1-3+SVP]。酵母单杂交表明:重组酵母菌Y1H[SOC1△1-3+FLC]和Y1H[SOC1△1-3+SVP]均能够在含有相应AbA背景浓度的培养基SD/-Leu/AbA*上正常生长。这说明酵母报告基因被激活，从而证明SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3小片段都能够被FLC和SVP蛋白所识别并结合。
　　⑵芥菜SOC1启动子的CArG-box缺失突变体与FLC、SVP蛋白互作检测。通过分别敲除SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3小片段中的CArG-box，得到了对应的芥菜SOC1启动子的CArG-box缺失突变体（Ⅰ型突变体），并分别命名为:Eliminate1、Eliminate2和Eliminate3。同理筛选出抑制酵母菌Y1H[pAbAi-Eliminate△1-3]生长的AbA的最低浓度，得到Y1H[pAbAi-Eliminate△1-3]的AbA背景浓度分别为100ng/ml、150ng/ml、100ng/ml。接着构建重组酵母菌Y1H[Eliminate△1-3+FLC]和Y1 H[Eliminate△1-3+SVP]。通过酵母单杂交技术验证发现:重组酵母菌Y1H[Eliminate△1-3+FLC]和Y1H[Eliminate△1-3+SVP]均不能够在含有相应AbA背景浓度的培养基SD/-Leu/AbA*上正常生长。这说明Eliminate1、Eliminate2和Eliminate3不能够被FLC和SVP蛋白所识别和结合。由此推断:SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3小片段中的CArG-box均是FLC和SVP蛋白识别和结合的DNA区段。
　　⑶芥菜SOC1启动子的CArG-box中A/T碱基互换突变体与FLC、SVP蛋白互作检测。通过将SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3小片段中CArG-box中的A/T碱基互换，最后得到了SOC1启动子的CArG-box中A/T碱基互换突变体（Ⅱ型突变体），分别命名为Exchange1、Exchange2和Exchange3。同理筛选抑制重组酵母菌Y1H[pAbAi-Exchange△1-3]生长的AbA的最低浓度，得到Y1H[pAbAi-Exchange△1-3]的AbA背景浓度分别为100ng/ml、200ng/ml、200ng/ml。接着构建重组酵母菌Y1H[Exchange△1-3+FLC]和Y1H[Exchange△1-3+SVP]，通过酵母单杂交技术验证发现:重组酵母菌Y1H[Exchange△1-3+FLC]和Y1H[Exchange△1-3+SVP]在含有相应AbA背景浓度的培养基SD/-Leu/AbA*上均不能正常生长。由此可见:SOC1启动子额Ⅱ型突变体突变体（Exchange1、Exchange2和Exchange3）不能与FLC、SVP蛋白结合。这说明SOC1启动子片段SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3中CArG-box能够特异被FLC、SVP蛋白所结合，发生蛋白质-DNA相互作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1.1 SOC1在花期调控网络中的功能

1.1.1 SOC1和光周期途径

1.1.2 SOC1和春化途径、自主途径

1.1.3 SOC1和赤霉素途径

1.1.4 SOC1和植物发育进程途径

1.2 FLC在花期调控网络中的功能

1.2.1 FLC与春化途径

1.2.2 FLC与自主途径

1.2.3 FLC与赤霉素途径

1.3 SVP在花期调控网络中的功能

1.3.1 SVP与自主途径

1.3.2 SVP与温敏途径

1.3.3 SVP与赤霉素途径

1. 4 FLC、SVP对SOC1的调控作用

1.4.1 MADS-box基因

1.4.2 FLC、SVP对SOC1的调控方式

1. 5 酵母单杂交技术

1. 6 试验流程概述

第二章 引言

第三章 芥菜SOC1启动子小片段构建

3.1 材料

3.2 方法

3.2.1 试剂配制

3.2.2 引物设计

3.2.3 SOC1启动子分段亚克隆

3.2.4 SOC1启动子小片段酵母重组质粒载体的构建

3.2.5 SOC1启动子小片段反应元件分析

3.3 结果与分析

第四章 SOC1启动子小片段和FLC、SVP相互作用的验证

4.1 材料

4.2 方法

4.2.1 试剂配制

4.2.2 酵母重组质粒pABAi-SOC1Δ1-3 转入Y1H Gold 酵母菌中

4.2.3 重组酵母菌Y1H[pAbAi-SOC1Δ1-3]AbA背景浓度的检测

4.2.4 酵母单杂交验证实验

4.3 结果分析

4.3.1 重组酵母菌Y1H[pAbAi-SOC1Δ1-3] 的AbA背景浓度

4.3.2 SOC1启动子小片段与FLC、SVP的相互作用

第五章 芥菜SOC1的启动子Ⅰ、Ⅱ型突变体片段与FLC、SVP的相互作用

5.1 材料

5.2 芥菜SOC1启动子Ⅰ、Ⅱ型突变体片段的获得

5.3 芥菜SOC1启动子Ⅰ型突变体和FLC、SVP作用验证

5.3.1 重组酵母Y1H[pAbAi-EliminateΔ1-3]构建

5.3.2 酵母单杂交验证试验

5.4 芥菜SOC1启动子Ⅱ型突变体和FLC、SVP作用验证

5.4.1 重组酵母Y1H[pAbAi-EliminateΔ1-3]构建

5.4.2 酵母单杂交验证试验

5.5 结果分析

5.5.1 芥菜SOC1 Ⅰ启动子型突变体与FLC、SVP相互作用

5.5.2 芥菜SOC1 Ⅱ启动子型突变体和FLC、SVP相互作用

第六章 讨论

6.1 酵母单杂交系统的优点

6.2 CArG-box特异性

6.3 异源蛋白与CArG-box

6.4 芥菜FLC、SVP蛋白与SOC1启动子结合区域的筛选

第七章 结论

7.1 获得了芥菜SOC1启动子小片段及其Ⅰ、Ⅱ型突变体

7.2 芥菜SOC1启动子上的CArG-box是SOC1与FLC、SVP的互作区域

7.3 芥菜SOC1启动子上CArG-box在SOC1-FLC或SOC1-SVP互作中具有特异性

参考文献

致谢

在校期间发表的学术论文