结核分枝杆菌GntR/FadR家族转录调控因子Rv0494蛋白的功能研究

摘要

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是结核病的病原菌。众所周知，结核病是一种慢性呼吸道的传染病，肺部通常最易受侵袭，大约占10％发展为活动性肺结核。结核分枝杆菌是目前致死率最高的致病菌之一[1]。研究表明:每年有上百万的人感染结核病，已经成为死亡率仅次于艾滋病的第二大传染病。尽管最近几十年已经有很多研究致力于研发新药物来治疗结核病，但是由于多重耐药、广泛耐药性结核分枝杆菌的出现，结核分枝杆菌生物膜的形成以及与HIV的共感染[2，3]，给人类治疗结核病带来极大的挑战。
　　结核分枝杆菌在面对各种压力环境下，主要通过进化出一系列的修复机制、耐受机制以及自身内部的调控机制来维持其生存和繁殖。其中，结核分枝杆菌自身内部的转录调控机制对其在各种压力环境下的生存、致病性至关重要。目前，有研究表明:结核分枝杆菌的基因组中包含大量的潜在具有转录功能的基因，如GntR家族，因该家族成员和葡萄糖酸盐调控因子具有相似性，故被称为GntR[4]。GntR家族许多成员已经被证明对结核分枝杆菌在各种压力环境下的存活发挥着重要的作用。该家族的一个显著特点是N末端具有保守的DNA结合区域，主要是发挥转录调控功能的结合区域，但是其C末端域不具有保守性，主要是因为C末端包含不同的效应器结合域或者低聚物[5]。鉴于C末端域的异质性，我们将GntR家族成员分类为不同的亚家族。目前，GntR家族成员可分为4个亚家族，分别是:FadR，HutC，MocR，YtrA亚家族[6，7]，Rv0494蛋白则属于FadR亚家族。这些调控因子在细胞生理中发挥重要的功能，多数转录因子参与调控各种代谢途径的基因，例如氧化压力环境下所涉及到的氨基酸代谢或者其他代谢途径[8]。
　　GntR家族转录因子通常发挥双重调控功能，即同时具有转录激活和转录抑制的作用。在某些细菌中或者在某种特定条件下，GntR家族成员具有激活特定基因转录的功能，同时也能激活或阻遏其他基因转录。有趣的是，许多转录调控因子还具有自调控功能，能够调控自身基因的转录[9]。
　　研究表明，结核分枝杆菌H37Rv基因组中有7个基因包括:Rv0043c，Rv0165c，Rv0494，Rv0586, Rv0792c，Rv1152和Rv3060c编码GntR蛋白，其中Rv0043c，Rv0165c，Rv0494，Rv0586和Rv3060c(Ⅰ和Ⅱ)编码的相应蛋白属于FadR亚家族成员，FadR亚家族在GntR家族中最具有代表性[4]。因此，本文选择FadR亚家族的Rv0494蛋白进行研究其相关的转录调控功能。
　　目前，结核分枝杆菌GntR家族成员在分枝杆菌中是如何发挥相关转录调控功能尚不明确。耻垢分枝杆菌是一种快生型的非致病性分枝杆菌，是被广泛应用于研究致病性结核分枝杆菌的模式细菌。
　　本文为研究GntR家族转录因子在分枝杆菌中的相关功能，从结核分枝杆菌基因组克隆Rv0494基因，分别进行酶切连接构建pET28-Rv0494和pNIT-Rv0494重组质粒，从而通过构建过表达菌株M.s-pNIT(myc)-Rv0494，采用电泳迁移率检测(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)，启动子活性测定等实验方法，证实Rv0494蛋白能与自身启动子结合，这部分主要研究了该蛋白的自调控功能。
　　第二部分实验进一步研究Rv0494过表达是否对耻垢分枝杆菌的菌落形态、生物膜形成、滑动能力以及对一线抗结核药物的耐受等产生影响，同时应用十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，全文简写为SDS）、过氧化氢(H2O2)、饥饿环境(PBS)、氧化剂联氨等模拟各种压力环境，鉴定Rv0494蛋白是否参与胁迫应答，同时通过测定生长曲线检测Rv0494对过表达菌株M.s-pNIT(myc)-Rv0494生长速率的影响。通过以上实验结果显示Rv0494蛋白能特异性与自身启动子结合属于自调控转录因子，通过加入β-巯基乙醇处理证实Rv0494蛋白在体外是以单体形式存在。
　　另外，实验进一步空载和实验组重组耻垢分枝杆菌单菌落形态、滑动能力和生物膜形成、对抗生素的耐受以及脂肪酸的种类均无明显差异。因此，初步证实Rv0494蛋白对耻垢分枝杆菌的表型无明显影响。同时，通过测定生长曲线发现Rv0494重组蛋白对宿主菌的生长速率无明显影响。但是，我们采用滴板和双层琼脂法比较对照菌和重组菌在H2O2和SDS以及氧化剂联氨压力下的存活差异。结果证实，当H2O2浓度在1％，SDS终浓度为5％时，重组菌的抑菌圈明显小于空载菌，具有统计学差异。当联氨浓度为5mM时重组菌完全不生长，而空载菌能够生长。这可能是因为该蛋白下调了重组菌的生理活性相关基因，从而减缓了宿主菌的生长。总的来时，该蛋白在分枝杆菌代谢以及应激条件下的存活发挥重要的作用。并且对各种压力环境条件下产生应答，发挥其转录调控功能。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 综述

1．1 引言

1．2 转录调控因子的基本特征

1．2．1 转录因子的分类

1．2．2 转录因子的结合位点

1．2．3 转录调控区

1．2．4 转录调控因子的结构形式

1．3 GntR家族转录调控因子的特征

1．3．1 GntR家族转录调控因子的研究现状

1．3．2 Rv0494蛋白作为转录因子可能调控的基因

1．4 研究转录因子调控功能的实验方法

1．4．1 CHIP-Seq方法

1．4．2 凝胶迁移或电泳迁移率检测

1．4．3 DNaseI法

1．4．4 点突变技术

1．4．5 报告基因分析

1．5 转录调控因子研究意义

第2章 引言

第3章 材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 化学试剂

3．1．2 实验菌株、质粒载体和引物

3．1．3 培养基和主要试剂

3．1．4 实验所需试剂

3．1．5 主要实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 结核分枝杆菌Rv0494基因的体外扩增

3．2．2 PCR扩增产物的回收

3．2．3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

3．2．4 Rv0494基因的TA克隆

3．2．5 重组质粒的提取

3．2．6 Rv0494重组质粒的构建

3．2．7 Rv0494重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

3．2．8 Rv0494重组耻垢分枝杆菌的构建

3．2．9 启动子活性检测

3．2．10 Rv0494蛋白的转录调控功能分析

3．2．11 Rv0494转录调控因子的结构形式

3．2．12 菌落形态观察

3．2．13 耻垢分枝杆菌生物膜培养方法

3．2．14 耻垢分枝杆菌滑动实验

3．2．15 Rv0494对重组耻垢分枝杆菌生长的影响

3．2．16 微孔培养板倍比稀释法测定MIC

3．2．17 Rv0494对重组耻垢分枝杆菌在饥饿、氧化压力环境下的影响

3．2．18 双层琼脂法测Rv0494对重组耻垢分枝杆菌抵抗过氧化氢的影响

3．2．19 双层琼脂法测Rv0494对重组耻垢分枝杆菌抵抗SDS的影响

3．2．20 脂肪酸GC-MS样品提取

3．3 数据处理与统计分析

第4章 结果与分析

4．1 从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Rv0494目的基因

4．2 构建BL21-pET28-Rv0494重组大肠杆菌

4．3 Rv0494重组蛋白在BL21大肠杆菌中的表达纯化

4．4 构建pNIT(myc)-Rv0494重组耻垢分枝杆菌

4．5 Rv0494重组蛋白在耻垢分枝杆菌中成功表达

4．6 Rv0494启动子活性分析

4．7 EMSA检测Rv0494蛋白与自身启动子的相互作用

4．8 Rv0494调控因子在体外以单体的结构形式存在

4．9 Rv0494对重组耻垢分枝杆菌的菌落形态无明显影响

4．10 Rv0494对重组耻垢分枝杆菌生物膜形成无明显影响

4．11 Rv0494对重组耻垢分枝杆菌的滑动能力无明显影响

4．12 Rv0494对重组耻垢分枝杆菌的生长速率无明显影晌

4．13 Rv0494对重组耻垢分枝杆菌对各种抗生素的MIC无明显差异

4．14 Rv0494对重组耻垢分枝杆菌在饥饿条件下的存活无明显影响

4．15 Rv0494减弱重组耻垢分枝杆菌对氧化剂联氨的耐受

4．16 Rv0494减弱重组耻垢分枝杆菌对过氧化氢(H2O2)的耐受

4．17 Rv0494减弱重组耻垢分枝杆菌对SDS压力环境的耐受

4．18 脂肪酸GC-MS分析

第5章 结论与展望

5．1 实验结论

5．2 讨论与展望

参考文献

致谢

硕士期间发表及撰写的文章