柑橘黄龙病菌原噬菌体的基因区域遗传多态性研究

摘要

柑橘黄龙病(HLB)作为世界柑橘产业最具威胁性的一种病害，在亚洲、非洲、大洋洲和南北美洲近50多个国家和地区危害并继续蔓延;HLB能侵染几乎所有的柑橘类植株，田间症状主要表现为叶片斑驳型黄化、均匀型黄化、缺素型黄化和“红鼻子”果等，造成植株寿命减短，果品质劣产量降低，带来巨大经济损失。黄龙病病原暂定为韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)的3个种:亚洲种(CLas)、非洲种(CLaf)和美洲种（CLam）。其中，CLas在世界分布最为广泛，中国和美国的黄龙病菌均为该种。HLB可经嫁接传播，亦可经菟丝子传播至常春花等;在田间主要经柑橘木虱传播，已知传媒有亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）、非洲柑橘木虱（Trioza erytreae）和柚喀木虱（Cacopsylla citrisuga）。该病目前尚无特效药剂治疗，也无抗（耐）病品种可供生产应用，目前最有效的防控措施有三项:1.使用无病苗木;2圾时砍除病树;3.大面积联防联控木虱。
　　由于人工难培养的特性，该病病原科赫氏验证尚未完成，因此对病原菌生物学和种群遗传结构特征的了解有限。鉴于CLas的遗传多样性研究的不足，尤其是中国CLas种群多样性研究仍有待完善，本学位论文以已公布的病原菌亚洲种全基因组序列（美国佛罗里达Psy62、广西GX-1、广东A4、美国加利福尼亚HHAC）为参考，通过序列比对筛选得到一些差异位点，结合课题组前期已筛选的位点，用于分析CLas遗传多样性。本研究主要获得如下结果:
　　1、HLB微型反向转座重复元件的检测。微型反向重复转座元件（MITE）作为一类特殊的DNA转座子，在基因调控、基因组进化及生物多样性形成中扮演重要角色。最近从CLas中鉴定了两个非自主转座元件，即MCLas-A和MCLas-B，其中MCLas-A因具有跳跃性而被认为是活性的转座元件。为进一步明确当前中国黄龙病菌样品中两种非自主转座子的发生、分布及其转座情况，本研究在前期实验基础上，对近期收集的222个黄龙病阳性样品进行分析，结果显示扩增条带中以B720(MCLas-B)和B350（推断的MCLas-A转座产物）占主导，而B630条带（活性MCLas-A）仅在贵州的1个样品中出现，表明当前中国样品中MCLas-A高频转座，其转座的生物学意义尚有待解析。对代表性B350扩增子进行序列分析表明其序列类型与之前报道的一致，在中国样品中仍存在6种主要序列类型。
　　2、推断转座酶和MITE位点序列分析。前期研究表明在CLas基因组中MCLas-A和MCLas-B的上游基因均为推断的转座酶基因。本研究旨在分析该上游转座酶基因的序列变异，并探讨这些序列变异与非自主转座元件活性之间的相关性。通过设计可扩增推断转座酶基因和下游转座元件的引物，对来自中国、巴西和美国的43个代表性黄龙病菌分离物进行PCR和序列分析。PCR扩增可产生六种主要的扩增子，进而对所有扩增子类型进行测序发现共有12种序列型，其中3种序列型(T4、T5-2、T6)为首次报道。在序列型T5-2和T6中检测到重组事件，且所有巴西样品均含有这两种序列型。值得注意的是，在活性转座元件MCLas-A的上游序列中没有发现序列变异和重组现象，表明转座酶基因的保守性可能与非自主元件的转座活性紧密相关。聚类分析结果显示，所有序列可分为包含5个亚组的2个组群，且部分亚组对应不同的样品来源，尤其是云南瑞丽样品、巴西圣保罗样品和美国佛罗里达少量样品。重组和进化分析表明中国、巴西和美国柑橘黄龙病菌种群显著不同;与美国佛罗里达样品相比，美国加利福尼亚分离物序列与中国样品相似性更高。
　　3、黄龙病菌中大片段序列缺失区域侧翼序列分析。中国西南地区（云南、四川、贵州）CLas样品原噬菌体区域（CLIBASIA_05640-CLIBASIA_05660）中存在大片段序列缺失的现象，但其侧翼序列是否有类似的多态性现象尚有待研究。本研究进一步收集云南和四川8个CLas样品，利用前期已设计的引物对Lap5640f/Lap5660r对样品进行扩增，发现云南、四川样品中部分样品存在预期的S550条带（即存在1033nt删减），值得一提的是，除发现该特异分子标记，在云南元江的样品(YNYJ-E)中扩增出1条特异条带，命名为S1000。进而设计引物对TR1222067f/TR1224135r扩增上游区域（CLIBASIA_05625-CLIBASIA_05660），结果表明该引物能扩增出中国西南地区样品中对应的3种条带类型。序列分析表明相对Psy62株系基因组，云南YNYJ-E样品的序列在CLIBASIA_05645位点有4处小片段插入及1处缺失，CLIBASIA_05650位点及其下游基因间隔区出现3处缺失，CLIBASIA_05655位点出现1处缺失。对该特殊株系的进一步研究有望丰富对病原菌多态性及基因组可塑性的认识。

目录

声明

摘要

一 文献综述

1．1 柑橘黄龙病症状特征及危害

1．1．1 症状

1．1．2 寄主

1．1．3 发生特点

1．1．4 危害

1．2 黄龙病病原特征

1．2．1 病原分类

1．2．2 病原分布

1．2．3 病原流行规律

1．3 黄龙病检测鉴定

1．3．1 田间鉴定

1．3．2 电镜观察

1．3．3 血清学检测

1．3．4 核酸分子杂交

1．3．5 PCR检测技术

1．4 CLas基因组研究进展

1．4．1 psy62基因组

1．4．2 gxpsy基因组

1．4．3 A4基因组

1．4．4 HHCA基因组

1．4．5 与CLas相关的噬菌体

1．5 病原遗传多态性研究

1．5．1 rDNA

1．5．2 SSR

1．5．3 噬菌体区域

1．6 黄龙病防控

1．6．1 严格植物检疫

1．6．2 防除传毒媒介

1．6．3 脱毒并推广无病苗木

1．6．4 其他防治技术

二 引言

三 黄龙病菌非自主转座子的检测鉴定

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 供试材料

3．1．2 主要仪器与试剂

3．2 实验方法

3．2．1 试剂配置

3．2．2 总核酸提取

3．2．3 引物

3．2．4 PCR反应

3．2．5 PCR产物纯化与克隆

3．2．6 测序

3．3 结果与分析

3．3．1 疑似柑橘黄龙病样品韧皮部杆菌检测

3．3．2 黄龙病样品MITEs检测

3．3．3 序列分析

3．4 结论与讨论

四 转座酶基因推断和MITE位点序列分析

4．1 实验材料与仪器

4．1．1 供试材料

4．1．2 主要仪器与试剂

4．2 实验方法

4．2．1 试剂配置

4．2．2 总核酸提取

4．2．3 引物

4．2．4 PCR反应

4．2．5 PCR产物纯化与克隆

4．2．6 测序分析

4．3 结果与分析

4．3．1 PCR扩增子的多态性和序列分析

4．3．2 重组序列分析

4．3．3 系统进化分析

4．4 结论与讨论

五 原噬菌体中大片段序列缺失区域侧翼序列分析

5．1 实验试剂与材料

5．1．1 供试材料

5．1．2 实验仪器与试剂

5．2 实验方法

5．2．1 试剂配制

5．2．2 总核酸提取

5．2．3 引物

5．2．4 PCR反应

5．2．5 PCR产物纯化与克隆

5．2．6 测序分析

5．3 结果与分析

5．3．1 PCR检测结果

5．3．2 序列分析

5．4 结论与讨论

参考文献

附录

致谢

发表论文及参研课题情况