内生枯草芽孢杆菌Itb57对烟草疫霉菌的抑制机理

摘要

烟草黑胫病(Tobacco black shank)是1896年Breda de Haan在印尼爪哇烟草上发现的一类土传性真菌病害，烟农俗称“黑根”、“黑秆疯”。多数发生于成株期，也有少部分苗床期发生，是烟草生产上的毁灭性病害。在我国，除了较冷的黑龙江省外，其他产烟省均有不同程度的发生，且危害较为普遍和严重，发病率一般在10％-15％，年均经济损失达1亿元人民币以上。因此，研发高效的防治烟草黑胫病的生物制剂，对烟草的产量和农民的增收均有重要意义。
　　枯草芽孢杆菌Itb57是从健康烟株中分离获得的，前期研究表明该菌株发酵液对烟草黑胫病的温室防治效果达69.3％，且大田防治效果连续两年均在60.0％以上，防治效果稳定，因此，本文进一步从烟草疫霉菌细胞形态学、生理生化水平及Itb57菌株产拮抗物质种类等几方面探索其抑制疫霉菌生长的机理，为该菌的生防利用提供理论依据。结论如下:
　　1.Itb57菌株发酵滤液对烟草疫霉菌生长的抑制作用
　　烟草疫霉菌经Itb57菌株发酵滤液处理后，疫霉菌丝生长受明显抑制，抑制率为39.6％;用不同浓度发酵滤液处理疫霉菌丝，结果表明随着发酵滤液浓度的增加，孢子囊形成抑制率、孢子囊萌发抑制率及休止孢子萌发抑制率逐渐增大，当发酵滤液浓度为50％时，孢子囊形成抑制率达到79.7％，孢子囊萌发抑制率为70.8％，浓度为50％的发酵滤液培养休止孢子8h，其萌发抑制率达59.6％，显微观察发现Itb57菌株发酵滤液对疫霉菌孢子囊的形态影响较小。
　　2.Itb57菌株发酵滤液对烟草疫霉菌生理生化的影响
　　经Itb57菌株发酵滤液处理后，疫霉菌丝细胞壁主要成分β-1，3-葡聚糖含量显著低于对照，当发酵滤液浓度为5％时，碱溶性β-1，3-葡聚糖、碱不溶性β-1，3-葡聚糖、水溶性β-1，3-葡聚糖含量分别为7.2％、16.7％及12.3％，与对照相比，分别降低了51.2％、42.5％和39.4％;随发酵滤液浓度的增加，疫霉菌β-1，3-葡聚糖合成酶活性逐渐降低，而培养疫霉菌丝溶液的电导率值及细胞膜丙二醛含量逐渐增加，表明细胞膜完整性被破坏，膜脂过氧化严重;用浓度为5％的发酵滤液处理时，菌丝DNA含量与对照相比，降低了14.6％;疫霉菌线粒体复合酶Ⅰ、复合酶Ⅱ、复合酶Ⅲ、复合酶Ⅳ活性显著低于对照;菌丝蛋白质含量与对照无显著差异。
　　3.Itb57菌株产拮抗物质的种类
　　Itb57菌株发酵滤液经浓度为20％，30％，40％，50％，60％，70％硫酸铵沉淀后收集粗提液，拮抗活性检测结果发现40％的硫酸铵盐析所得粗提液对疫霉的生长已有抑制作用，当浓度为70％的硫酸铵盐析所得粗提液对疫霉菌的生长抑制效果最好，抑菌圈直径为1.5 cm;且随着硫酸铵浓度的增加，所得粗提液的蛋白质含量也增加;粗提蛋白质SDS-PAGE电泳检测结果表明相对分子质量大小约为45kDa的蛋白质可能与拮抗活性有关;分子检测结果发现Itb57菌株有产芽孢结合蛋白（TasA）的基因。
　　Itb57菌株发酵滤液经盐酸沉淀后收集的脂肽粗提液对烟草疫霉菌抑菌圈为1.2 cm;通过高效液相色谱分析，初步确定Itb57菌株脂肽粗提液中存在表面活性素;且分子检测结果发现Itb57菌株有产表面活性素(srfA)的基因。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 烟草黑胫病病原菌概述

1．1．1 烟草黑胫病病原特性

1．1．2 诱导烟草黑胫病菌产孢及游动孢子释放的方法

1．1．3 烟草黑胫病病原菌生物学特性的研究

1．2 植物内生细菌研究进展

1．2．1 植物内生细菌概念

1．2．2 植物内生细菌的生物防治研究

1．3 枯草芽孢杆菌在生物防治中的应用

1．3．1 芽孢杆菌拮抗病原菌机理的研究

1．3．2 枯草芽孢杆菌抗菌物质种类

1．3．3 枯草芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化

引言

第2章 Itb57菌株滤液对烟草疫霉菌的抑制作用

2．1 材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 主要试剂及仪器

2．2 方法

2．2．3 Itb57菌株发酵滤液制备

2．2．4 疫霉菌饼培养

2．2．5 Itb57菌株发酵滤液对疫霉菌丝生长的影响

2．2．6 Itb57菌株发酵滤液对疫霉孢子囊形成的影响

2．2．7 Itb57菌株发酵滤液对疫霉菌孢子囊萌发的影响

2．2．8 Itb57菌株发酵滤液对疫霉菌休止孢子萌发的影响

2．3 结果与分析

2．3．1 Itb57菌株发酵滤液对疫霉菌丝生长的影响

2．3．2 Itb57菌株发酵滤液对疫霉菌孢子囊形成的影响

2．2．3 Itb57菌株发酵滤液对疫霉菌孢子囊萌发的影响

2．2．4 Itb57菌株发酵滤液对疫霉菌孢子囊形态的影响

2．2．5 Itb57菌株发酵滤液对疫霉菌休止孢子萌发的检测结果

2．4 讨论

第3章 Itb57菌株发酵滤液对烟草疫霉生理生化的影响

3．1 材料

3．1．1 供试菌株

3．1．2 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 菌株Itb57发酵滤液对疫霉细胞壁β-1，3-葡聚糖含量的影响

3．2．2 菌株发酵滤液对疫霉菌β-1，3-葡聚糖合成酶活性影响

3．2．3 菌株发酵滤液对细胞膜透性的影响

3．2．4 菌株发酵滤液对疫霉菌细胞膜丙二醛含量的影响

3．2．5 菌株发酵滤液对疫霉蛋白质含量及合成的影响

3．2．6 菌株发酵滤液对疫霉DNA合成的影响

3．2．7 菌株发酵滤液对疫霉线粒体复合酶活性的影响

3．3 结果与分析

3．3．1 菌株发酵滤液对细胞壁β-1，3-葡聚糖含量的影响

3．3．2 菌株发酵滤液对疫霉菌β-1，3-葡聚糖合成酶活性的影响

3．3．3 菌株发酵滤液对细胞膜透性的影响

3．3．4 对细胞膜丙二醛含量影响

3．3．5 菌株发酵滤液对疫霉蛋白质含量及合成的影响

3．3．6 菌株发酵滤液对疫霉DNA含量及合成的影响

3．3．7 对线粒体复合酶活性的影响

3．4 讨论

第4章 Itb57菌株产抗生素的研究

4．1 材料

4．1．1 供试菌株

4．1．2 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 菌株发酵滤液抑菌活性物质粗提及拮抗活性检测

4．2．2 抗菌粗提蛋白溶液蛋白质含量测定

4．2．3 抗菌粗蛋白SDS-PAGE电泳分析

4．2．4 粗提脂肽高效液相色谱分析检测

4．2．5 Itb57菌株基因组DNA提取

4．2．6 Itb57菌株产抗生素生物合成基因的PCR检测

4．3 结果与分析

4．3．1 菌株发酵滤液粗提抑菌物质拮抗活性检测结果

4．3．2 粗提蛋白液中蛋白含量测定结果

4．3．3 粗提蛋白SDS-PAGE电泳检测结果

4．3．4 粗提脂肽高效液相色谱分析结果

4．3．5 表面活性素A合成基因检测

4．3．6 伊枯草菌素A合成基因检测

4．3．7 TasA合成基因检测

4．3．8 丰原素合成基因检测

4．4 讨论

结论与展望

参考文献

附录

致谢