朱砂叶螨适应取食棉花相关基因筛选及应用

摘要

植食性昆虫、叶螨与自然界植物在长期的进化过程中，逐渐形成寄主单食性和寄主多食性两种。朱砂叶螨（Tetranychus cinnabarinus）作为一种重要的多食性农业害螨，能够取食危害多种寄主植物。朱砂叶螨通过消化将从不同寄主植物获取的食物代谢成营养物质，为自身的生长发育提供物质基础，同时利用自身进化的解毒代谢系统，将接触到的外源有毒物质转化代谢为无毒物，这被认为是朱砂叶螨能够适应取食多种寄主植物的两条关键代谢通路。
　　本文利用高通量测序技术比较朱砂叶螨分别取食豇豆和棉花后数字基因表达谱，获得大量朱砂叶螨适应取食棉花的差异表达基因，明确了消化代谢和解毒代谢两大通路中差异表达的相关基因;并从两大通路中筛选出朱砂叶螨适应取食棉花的重要相关基因，克隆获得相关基因的开放阅读框序列并验证其表达水平。在此基础上，利用植物介导的RNAi技术将朱砂叶螨两条P450基因的部分互补DNA序列导入到棉花植株使其表达获得转基因棉;通过qPCR技术检测朱砂叶螨取食转基因棉后体内对应靶基因的表达水平;运用种群生命表技术比较、分析朱砂叶螨取食转基因棉后适合度代价变化，初步明确转基因棉的抗螨效果。获得的主要研究结果如下:
　　1.采用高通量测序技术比较朱砂叶螨转移取食棉花后(8h、50d)数字基因表达谱，结果显示朱砂叶螨从豇豆转移取食棉花后，有近500条基因差异表达，其中取食棉花8h后有174条基因差异表达（上调97，下调77），取食50d后有433条基因差异表达（上调384，下调49）。将差异基因比对到Nr、二斑叶螨基因组、COG、KEGG和GO等数据库，最终272条基因获得功能注释，其中与解毒代谢相关基因24条，与消化代谢相关基因17条。
　　2.根据表达谱获得的差异表达基因，从中筛选出4条朱砂叶螨适应取食棉花的重要相关基因。这4条基因表达差异倍数均高于4倍，表达丰度均超过18，功能分别注释为:细胞色素P450单加氧酶（tcCYP1和tcCYP2），羧酸酯酶(tcCCE)和丝氨酸蛋白酶(tcSP)。分别克隆获得tcCYP1基因开放阅读框1482 bp，GenBank登录号为KR002098; tcCYP2基因开放阅读框1512 bp，GenBank登录号为KR002099; tcSP基因开放阅读框891 bp，GenBank登录号为KR002101;获得tcCCE基因下游片段1417 bp，GenBank登录号为KR002100。qPCR检测结果显示，4条基因表达趋势与表达谱测序结果基本一致。
　　3.利用农杆菌介导法将两条P450基因的互补DNA序列导入棉花植株培育转基因棉，最终成功获得四株（P2，P4，P5和P6）转基因棉。qPCR技术检测目的基因表达水平结果显示，朱砂叶螨分别取食四株转基因棉24h后，两条P450基因在螨体内的表达水平均无显著差异;在P4植株生存一代后，螨体内tcCYP1基因的表达水平显著下调;在P2植株生存一代后，螨体内tcCYP2基因的表达水平显著下调，取食其余植株后均未检测到靶基因的下调变化。
　　4.运用种群生命表技术比较朱砂叶螨取食转基因棉和常规棉后各发育历期、产卵量和适合度代价等参数变化。结果显示，相对于取食常规棉，朱砂叶螨取食转基因棉P4植株后，产卵量显著降低，存在适合度代价（Rf为0.73）。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 朱砂叶螨简介

2 叶螨与寄主植物相互作用

3 高通量测序技术简介及应用

4 植物介导的RNAi技术简介及应用

第二章 朱砂叶螨寄主转换后表达谱分析

1 材料与方法

1．1 供试虫源

1．2 主要试剂和仪器

1．3 朱砂叶螨取食豇豆和棉花(8h和50d)总RNA提取

1．4 总RNA质量检测

1．5 朱砂叶螨数字基因表达谱测序流程及信息分析

1．6 荧光定量PCR技术验证表达谱测序准确性

2 结果与分析

2．1 朱砂叶螨总RNA质量检测

2．2 朱砂叶螨表达谱测序质量评估

2．3 朱砂叶螨表达谱差异基因统计

2．4 荧光定量PCR验证表达谱测序准确性

2．5 差异基因功能注释

2．6 差异基因GO功能显著性富集分析

2．7 差异基因KEGG功能注释

3 讨论

第三章 朱砂叶螨适应取食棉花相关基因筛选及相关基因cDNA克隆

第一节 朱砂叶螨适应取食棉花相关基因筛选

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 朱砂叶螨4条相关基因cDNA克隆

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三节 朱砂叶螨长期取食棉花后4条基因表达水平检测

1 材料与方法

2 结果与讨论

第四章 植物介导RNAi技术转基因棉培育及效果评价

第一节 转基因植株培育

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 转基因植株效果评估

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 展望

参考文献

致谢

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