桔小实蝇酚氧化酶酶学特性及其酶原基因的研究

摘要

酚氧化酶在昆虫的生长发育和变态过程中具有重要作用，该酶主要参与昆虫伤口愈合、黑化作用和硬化作用。其中，黑化与硬化在昆虫表皮的形成、抵御外源病原菌以及免疫反应中起到重要的作用。因此，酚氧化酶及其酶原蛋白成为昆虫生长发育与免疫反应研究的热点。桔小实蝇是一种极具破坏力的多食性害虫，可危害250多种果蔬。化蛹和羽化是昆虫在生长发育过程中，面临复杂环境而成功生存繁衍的重要变态过程。桔小实蝇成虫产卵于果实中，幼虫期主要在果实内部为害，造成果实腐烂落地，进而在土壤中化蛹羽化为成虫后继续为害。当前，对桔小实蝇的防治主要依靠化学药剂，导致桔小实蝇对多种化学药剂产生了抗性，所以寻找新方法新途径进行治理已刻不容缓。本学位论文研究以桔小实蝇为对象，以酚氧化酶及其酶原为靶标，针对桔小实蝇幼虫-蛹变态阶段该酶的作用开展了系统而深入地研究，主要结果如下:
　　1.桔小实蝇不同发育阶段及组织中酚氧化酶酶学特性及其酶原基因表达模式
　　以邻苯二酚为底物，分别测定桔小实蝇不同发育阶段酚氧化酶活力。结果表明:桔小实蝇在不同发育阶段酚氧化酶活力的高低存在显著性差异，其中3龄幼虫的酶活力最高，1龄幼虫的酶活力最低。测定桔小实蝇3龄幼虫表皮、脂肪体和中肠等组织的酚氧化酶活力，结果表明:桔小实蝇表皮、脂肪体和中肠等组织均可检测到酚氧化酶的活性。其中表皮中酚氧化酶活力最高，而脂肪体中酚氧化酶活力最低。
　　分析桔小实蝇酚氧化酶的动力学常数发现，以邻苯二酚为底物时，桔小实蝇不同发育阶段间酚氧化酶的米氏常数(Km)值差异显著，1龄、2龄幼虫中酚氧化酶的最大反应速度(Vmax)值显著大于3龄幼虫、蛹和成虫的Vmax。以L-多巴为底物结果大致相同。桔小实蝇不同组织间酚氧化酶的Km值无显著性差异，表皮酚氧化酶的Vmax值显著高于脂肪体和中肠酚氧化酶的Vmax值;但以L-多巴为底物时，各组织酚氧化酶的Km和Vmax均无显著性差异。桔小实蝇不同发育阶段及组织中酚氧化酶酶促反应的最适pH为7.5，温度为37℃。
　　采用qPCR技术，以α-Tubulin为内参基因，解析桔小实蝇酚氧化酶酶原基因(BdPPO1)在不同发育阶段及组织的表达模式。结果表明，BdPPO1主要在桔小实蝇幼虫-蛹转化期以及表皮中表达量较高，说明酚氧化酶活力及BdPPO1表达量与桔小实蝇生长发育紧密相关，尤其是在其变态发育阶段。
　　2.曲酸对桔小实蝇酚氧化酶及生长发育的影响
　　曲酸是酚氧化酶的典型抑制剂，能够有效的抑制昆虫酚氧化酶的活性。将曲酸加入到桔小实蝇人工饲料并喂食新孵化的幼虫，结果发现，桔小实蝇幼虫期和蛹期显著延长，化蛹率和羽化率显著降低，幼虫体态明显小于对照组。
　　以邻苯二酚为底物，喂食曲酸饲料的桔小实蝇幼虫体内及表皮中酚氧化酶酶活力显著降低，而BdPPO1基因表达量显著上调，推测桔小实蝇体内可能存在一种自我补偿机制。进一步分析酚氧化酶动力学发现，饲喂曲酸后酚氧化酶的Km值未发生显著变化，但Vmax值显著降低，酶促反应的最适pH和温度未发生变化。上述结果说明曲酸能够有效抑制桔小实蝇酚氧化酶的活性，并且导致桔小实蝇生长发育延迟。
　　3.20-羟基蜕皮酮(20E)及金属离子对桔小实蝇BdPPO1表达量的影响
　　对桔小实蝇3龄幼虫注射20E后，发现桔小实蝇幼虫提前化蛹。检测注射不同浓度的20E后BdPPO1的表达量发现，与对照相比，注射浓度为0.5μg/mL时该基因表达量显著上调，而注射浓度降低或提高至0.1μg/mL和1μg/mL时该基因的表达量显著下调。
　　离体酶活性测定发现，Zn2+、Mg2+、Ca2+和Cu2+等4种二价金属离子均能有效地激活并提高桔小实蝇酚氧化酶的活力。向新孵化幼虫饲喂含金属离子的人工饲料6d后，酚氧化酶活力显著升高，其中饲喂锌离子后酚氧化酶活力最高，而饲喂镁离子后酚氧化酶活力最低。进一步采用qPCR技术检测桔小实蝇BdPPO1表达量发现，饲喂4种金属离子后该基因的表达量均显著上调。上述结果说明，桔小实蝇BdPPO1表达量受20E调控，酚氧化酶作为一种金属酶，能够有效的被金属离子激活。
　　4.桔小实蝇BdPPO1基因的功能验证
　　利用RNAi技术进一步验证了桔小实蝇BdPPO1基因的功能。结果表明，对桔小实蝇3龄幼虫注射BdPPO1基因dsRNA24 h和48 h后， BdPPO1基因达量显著降低，幼虫出现不能正常化蛹、表皮黑化等现象，同时化蛹率显著降低。上述结果说明BdPPO1基因可作为一个潜在的靶标来开发新的防治药剂，特别是具有作为基于RNAi技术防控桔小实蝇及其它害虫的潜力。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1．1 昆虫酚氧化酶结构

1．2 酚氧化酶酶学性质

1．3 酚氧化酶分布与定位

1．4 酚氧化酶抑制剂

1．5 酚氧化酶原激活系统

1．6 酚氧化酶的生理作用

1．6．1 参与昆虫表皮的黑化与硬化

1．6．2 参与昆虫的免疫反应

1．6．3 参与昆虫的伤口愈合

引言

第二章 桔小实蝇不同发育阶段及组织酚氧化酶酶学性质比较研究

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂与仪器

1．3 试验方法

1．4 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 桔小实蝇不同发育阶段及组织酚氧化酶活力

2．2 酚氧化酶动力学特征参数及底物专一性

2．3 pH对不同发育阶段及组织酚氧化酶活力的影响

2．4 温度对不同发育阶段及组织酚氧化酶活力的影响

3 讨论

第三章 桔小实蝇不同发育时期及组织酚氧化酶原基因的表达模式

1 材料与方法

1．1 供试虫源

1．2 主要试剂(盒)及仪器

1．3 总RNA提取

1．4 基因组DNA的去除

1．5 第一链cDNA反转录

1．6 引物设计

1．7 定量PCR

2 结果与分析

2．1 引物扩增效率

2．2 桔小实蝇不同发育时期PPO1基因的表达分析

2．3 桔小实蝇不同组织中尸PPO1基因的表达分析

3 讨论

第四章 曲酸对桔小实蝇酚氧化酶及生长发育的影响

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂与仪器

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 曲酸对桔小实蝇生长发育的影响

2．2 曲酸对桔小实蝇体内酚氧化酶活力的影响

2．3 曲酸对桔小实蝇体内BdPPO1表达量的影响

2．4 曲酸对桔小实蝇酚氧化酶底物专一性及动力学特征参数的影响

2．5 曲酸对桔小实蝇酚氧化酶的离体抑制作用测定

2．6 曲酸处理后桔小实蝇酚氧化酶最适pH和最适温度测定

3 讨论

第五章 20E及金属离子对桔小实蝇BdPPO1表达量的影响

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂与仪器

1．3 试验方法

1．4 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 金属离子对桔小实蝇离体酚氧化酶活力的影响

2．2 金属离子处理后桔小实蝇体内酚氧化酶的活力测定

2．3 金属离子处理后桔小实蝇BdPPO1表达量的分析

2．4 注射20E后BdPPO1表达量及桔小实蝇表型

3 讨论

第六章 桔小实蝇酚氧化酶原1基因的功能验证

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂与仪器

1．3 dsRNA引物的设计

1．4 dsRNA体外合成

1．5 显微注射

1．6 RNAi水平检测和表型观察

2 结果与分析

2．1 dsRNA的合成

2．2 定量PCR检测目的基因的沉默效率

2．3 RNAi效果的观察

3 讨论

第七章 主要结果、结论与研究展望

1 主要结果与结论

2 研究展望

参考文献

硕士在读期间发表的论文

致谢