家蚕茧丝中抑菌蛋白的鉴定与活性研究

摘要

家蚕是鳞翅目昆虫的代表，生长发育需要经过完全变态的蛹期，才能蜕变成为成虫。其幼虫变态发育成蚕蛹后则不吃不动，面临着众多天敌，捕食者和病原微生物的侵袭，缺乏抵抗能力。因此，在长期的进化过程中家蚕进化出了吐丝作茧保护蚕蛹的本能。同时也因其能吐丝作茧使家蚕成为了具有很高经济价值的昆虫。
　　蚕茧的主要成分是丝素和丝胶，它们构成的丝纤维结构具有杰出的物理性能，能为蚕蛹提供完美的防护。另外，推测蚕茧中含有的众多蛋白可以通过生化的手段抵御病原微生物的入侵。为了探究茧丝蛋白是否具有抑菌的作用，并找到发挥抑菌作用的蛋白成分，本研究首先对细菌（大肠杆菌）和真菌（球孢白僵菌）进行了抑菌实验的方法摸索，实验结果发现茧丝蛋白能够抑制球孢白僵菌孢子的萌发;进一步通过活性染色与酶活测定，发现抑菌组分与蛋白酶抑制剂相关;最后通过LC-MS/MS蛋白质组学技术，鉴定到其中起抑菌作用的主要组分是蛋白酶抑制剂。主要研究结果如下:
　　1.茧丝蛋白抑制细菌和真菌生长的方法摸索与条件
　　确立选取了大肠杆菌作为实验对象，采用100 mM Tris-HCl提取茧丝的活性蛋白成分，利用不同质量的茧丝蛋白，通过滤纸片法、打孔法、牛津杯法、OD值测定法和培养涂板法对不同浓度的大肠杆菌进行抑菌实验。结果均显示提取的茧丝蛋白对大肠杆菌的生长没有明显的抑制效果。此结果与已报道文献相同。又选取了家蚕最主要的一种致病菌—球孢白僵菌作为实验的靶标。首先，建立了检测茧丝蛋白抑制球孢白僵菌的方法—孢子孵育法。通过摸索条件，发现最适宜培养条件为26℃，80 rpm，最适观察时间为16h，加入茧丝蛋白的最适质量为150μg。用最上述条件来进行实验检测，发现提取的可溶活性茧丝蛋白能够显著地抑制球孢白僵菌孢子的萌发。同时，选取了一种广谱抗真菌药物—制霉菌素来作为阳性对照，用以上的最适条件进行球孢白僵菌孢子孵育实验。通过对比，发现150μg茧丝蛋白相当于0.3～0.5μg的制霉菌素的抑真菌效果。
　　2.茧丝蛋白中抑制真菌生长物质的鉴定
　　为了揭示抑真菌蛋白在茧层中的分布情况，首先将茧壳从内到外分为6层，命名为L1、L2、L3、L4、L5和茧网（Scaffold），分别提取了可溶活性蛋白。利用蛋白酶K作为靶酶来对各茧层的可溶蛋白进行活性染色和抑制活性，发现从内层到外层，茧壳中的蛋白酶抑制剂含量呈增加趋势。将各茧层蛋白与孢子进行共孵育，发现从茧壳的内层到外层，孢子萌发率呈减少趋势，这与蛋白酶抑制剂含量分布正好相反。因此，推测抑制球孢白僵菌孢子萌发的物质可能是蛋白酶抑制剂。由于蛋白酶抑制剂内部一般含有多对分子内二硫键，因此其结构非常稳定，可以耐高温。于是，将各茧层蛋白进行煮沸处理，离心后去除沉淀，将剩余蛋白与蛋白酶K进行活性染色和抑制活性测定，以及与球孢白僵菌孢子进行孵育实验。实验结果显示，煮沸后的各茧层蛋白仍然具有蛋白酶K的抑制活性，同时也能明显抑制球孢白僵菌孢子的生长，且抑制趋势与未处理的实验组一致。实验还发现煮沸后的茧层蛋白的孢子萌发率均低于未处理的蛋白，推测是由于加热处理去除了一部分沉淀，相当于提高了蛋白酶抑制剂的含量，所以效果更好。
　　为了鉴定清楚茧丝蛋白中起抑菌作用的组分以及提取蛋白中的抑菌组分含量，选择抑制球孢白僵菌效果最好的最外层茧网蛋白、煮沸后的茧网蛋白以及热处理过程中出现的蛋白质沉淀三种实验处理样品分别进行LC-MS/MS的鉴定。在茧网蛋白中，共鉴定到129个蛋白，其中30个为蛋白酶抑制剂。这些蛋白酶抑制剂含量占茧网可溶蛋白总量的89.1％。而煮沸后的茧网蛋白中蛋白酶抑制剂的含量提高到93.4％。煮沸后的沉淀中大部分为酶类，含量为65.1％。通过对未煮沸和煮沸后的茧网蛋白的LC-MS/MS数据进行信息分析，结果显示，在蛋白酶抑制剂中，Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂BmSPI51的丰度最高，在所有蛋白酶抑制剂中分别占67％和66％，第二高丰度的蛋白酶抑制剂为TIL类丝氨酸蛋白酶抑制剂BmSPI39，占22％和25％。其他高丰度的蛋白酶抑制剂还有羧肽酶抑制剂、TIL类丝氨酸蛋白酶抑制剂BmSPI38等。由此可以证明，提取的可溶活性茧丝蛋白中主要是蛋白酶抑制剂在发挥抑制球孢白僵菌孢子萌发的作用。
　　3.茧丝蛋白中高丰度蛋白酶抑制剂抑菌实验检测
　　为了进一步验证上述结论，从茧网蛋白中天然纯化了蛋白酶抑制剂BmSPI51，但发现其抑制活性较弱。又通过原核表达得到了蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39两种活性蛋白。将这三种蛋白酶抑制剂进行孢子孵育实验检测。结果显示，蛋白酶抑制剂BmSPI51对球孢白僵菌孢子萌发和生长没有明显的抑制效果，而蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39能够显著地抑制球孢白僵菌孢子的萌发和生长。由此可以证明，茧丝蛋白中的蛋白酶抑制剂可以通过抑制微生物的生长，达到保护蛹的作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 家蚕致病性微生物

1．2 茧丝蛋白抗微生物研究

1．3 茧丝蛋白的鉴定

1．4 蛋白酶抑制剂

1．4．1 蛋白酶抑制剂抑制球孢白僵菌的报道

1．4．2 蛋白酶抑制剂的分类

1．5 抑菌实验的方法

1．5．1 常用的细菌抑菌实验方法

1．5．2 常用的真菌抑菌实验方法

1．6 茧丝在生产中的应用

1．6．1 日用品领域

1．6．2 医用生物材料领域

第二章 引言

2．1 研究背景、目的及意义

2．2 研究内容

2．3 研究技术路线

第三章 茧丝蛋白抑制细菌和真菌生长的方法摸索与条件确立

3．1 实验材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器与试剂

3．1．3 试剂配制

3．1．4 实验方法与步骤

3．2 结果与分析

3．2．1 滤纸片法检测茧丝蛋白对大肠杆菌生长的影响

3．2．2 打孔法检测茧丝蛋白对大肠杆菌生长的影响

3．2．3 牛津杯法检测茧丝蛋白对大肠杆菌的生长影响

3．2．4 OD值法检测茧丝蛋白对大肠杆菌生长的影响

3．2．5 培养涂板法检测茧丝蛋白对大肠杆菌生长的影响

3．2．6 平板对峙法检测茧丝蛋白对球孢白僵菌孢子生长的影响

3．2．7 孢子孵育法检测茧丝蛋白对球孢白僵菌孢子萌发的影响

3．2．8 茧丝蛋白与制霉菌素抑菌实验对比

3．3 讨论

第四章 茧丝蛋白中抑制真菌生长组分的鉴定

4．1 实验材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器与试剂

4．1．3 试剂配制

4．1．4 实验方法与步骤

4．2 结果与分析

4．2．1 不同茧层蛋白对蛋白酶K的活性染色及酶活测定

4．2．2 不同茧层蛋白的球孢白僵菌孢子孵育实验

4．2．3 热处理后不同茧层蛋白的活性检测及球孢白僵蕾孢子孵育实验

4．2．4 茧丝蛋白中抑菌组分的LC-MS/ MS鉴定

4．3 讨论

第五章 茧丝蛋白中高丰度蛋白酶抑制剂的抑菌实验

5．1 实验材料与方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验仪器与试剂

5．1．3 试剂配制

5．1．4 实验方法与步骤

5．2 结果与分析

5．2．1 BmSPI51的天然纯化

5．2．2 BmSPI51的活性检测

5．2．3 BmSPI51的孢子孵育实验

5．2．4 BmSPI38、BmSPI39的原核表达与纯化

5．2．5 BmSPI38和BmSPI39的孢子孵育实验

5．3 讨论

第六章 综合与结论

参考文献

发表的论文和参与的课题研究

致谢