烟粉虱隐种内共生菌种类多样性分析及其优势共生菌对烟粉虱生长发育的影响

摘要

昆虫的内共生菌具有调节宿主生殖能力、协助宿主营养代谢、提高其温度适应性以及增强宿主的抗药性等功能，对昆虫种群的动态平衡起着关键性的作用。本论文利用宏基因组学的手段测定并分析了不同烟粉虱隐种内共生菌的种类和数量的差异，从基因水平分析预测了烟粉虱体内优势内共生菌的功能，并通过种群筛选进一步研究了其体内的优势菌对烟粉虱生长发育和个体发育的影响。主要研究结果如下:
　　(1)不同隐种所含内共生菌种类和丰富度存在显著差异。烟粉虱不同隐种的宏基因组数据分析结果表明，只存在烟粉虱MEAM1隐种的共生菌鉴定到种级水平15个，属级水平26个以及科级水平19个;只存在烟粉虱MED隐种的共生菌鉴定到种级水平52个，属级水平60个以及科级水平37个;烟粉虱MEAM1隐种和MED隐种共有的共生菌分类单位鉴定到种水平42个，属水平77个以及科水平60个;这两个隐种内共生菌鉴定到总计包括（不含有重叠部分）种级水平109个，属级水平163个以及科级水平116个。相对于MEAM1隐种，烟粉虱MED隐种中Pseudomonas属的种类如Pseudomonas mendocina以及Rickettisa属的种类如Rickettisa felis，Rickettisa bellii为优势种。
　　(2)成功筛选/分离出含R.bellii和不含R.bellii菌的烟粉虱种群。通过对全国大部分地区的烟粉虱种群内共生菌情况进行检测，并进行单独一雌一雄纯化培养五代后，获得了含有Rickettisa bellii菌和不含有Rickettisa bellii菌的烟粉虱种群，经分子鉴定为MED隐种。
　　(3)明确了R.bellii菌对烟粉虱个体发育和生长发育的影响。通过对实验种群生物学研究发现，含有R.bellii菌的烟粉虱从卵到初羽化阶段具有发育历期短、产卵量多、存活时间长、后代雌性个体多的生殖优势。对不同发育时期的烟粉虱雌虫解剖发现，在烟粉虱卵子发育过程中，初羽化阶段，不含有R.bellii菌的烟粉虱中未成熟卵子数量高于含有R.bellii茵的烟粉虱，但羽化第二天后，含有R.bellii菌的烟粉虱在卵子发育上更具有优势。
　　(4)不同发育历期的烟粉虱体内的R.bellii菌拷贝数动态变化。以不同发育历期的烟粉虱MED隐种的DNA为模板，利用绝对定量PCR技术检测了供试烟粉虱中R.bellii菌的拷贝数。结果表明R.bellii菌的拷贝数在伪蛹期前没有太大变化，在伪蛹期到初羽化发生显著性增长，随后下降，但第六天又开始发生显著上升趋势。
　　本论文通过宏基因组数据的分析，明确了不同隐种间的内共生菌种类差异及优势内共生菌，建立了特异性侵染烟粉虱的优势菌的烟粉虱种群，明确了优势种菌对烟粉虱发育历期、产卵量、存活率、抱卵量和后代性比等影响。为明确内共生菌如何影响烟粉虱生殖发育和扩散提供了理论依据，也为揭示内共生菌调控宿主适应环境能力奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．昆虫内共生菌的研究进展

1．1 昆虫内共生菌的概述

1．2 昆虫内共生菌的作用

1．3 研究昆虫内共生菌的意义

2．烟粉虱内共生菌的研究进展

2．1 烟粉虱的研究概况

2．2 烟粉虱的内共生菌研究概况

3．宏基因组学技术的研究进展

3．1 宏基因组技术的概述

3．2 宏基因组技术的应用

4．论文设计

4．1 立体依据

4．2 研究内容和方法

4．3 论文的技术路线

第二章 烟粉虱MED和MEAM1隐种菌胞的宏基因组

1．材料和方法

1．1 供试昆虫

1．2 供试植物

1．3 主要试剂与仪器

1．4 实验方法

2．结果与分析

2．1 菌胞宏基因组的测序分析

2．2 B．tabaci MEAM1和MED的内共生细菌组成

2．3 MED和MEAM1隐种优势度指数和多样性指数

2．4 宏基因组数据注释

3．讨论

第三章 烟粉虱含有R．bellii菌和不含有R．bellii菌的种群建立

1．材料与方法

1．1 供试植物

1．2 供试昆虫

1．3 主要试剂与仪器

1．4 实验所用引物

1．5 烟粉虱种群的筛选

1．6 烟粉虱DNA的提取

1．7 烟粉虱生物型和其体内内共生菌的PCR检测

1．8 原位杂交

2．结果与分析

2．1 烟粉虱生物型检测结果

2．2 种群建立鉴定结果

2．3 烟粉虱体内R．bellii菌的分布

3．讨论

第四章 R．bellii菌对烟粉虱MED隐种生长发育的影响

1．材料与方法

1．1 供试植物

1．2 供试昆虫

1．3 主要试剂

1．4 材料准备

1．5 实验方法

1．6 数据统计与分析

2．结果与分析

2．1 R．bellii菌对烟粉虱生长发育的影响

2．2 R．bellii菌对烟粉虱发育历期的影响

2．3 R．bellii菌对烟粉虱卵巢发育的影响

2．4 R．bellii菌对烟粉虱菌胞的影响

3．讨论

第五章 R．bellii菌在烟粉虱各发育阶段的拷贝数变化

1．材料与方法

1．1 供试植物

1．2 供试昆虫

1．3 试验仪器与试剂

1．4 样品准备

1．5 标准品以及探针制备

1．6 Q-PCR的反应体系建立

2．结果分析

2．1 标准品q-PCR检测结果

2．2 不同发育历期的烟粉虱q-PCR检测结果

2．3 不同发育历期烟粉虱MED隐种的R．bellii的拷贝数差异

3．讨论

第六章 结论与展望

1．结论

2．创新点

3．展望

参考文献

致谢

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