组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA对DNA双链断裂损伤修复路径的作用

摘要

目的：DNA分子结构的完整性对细胞生存至关重要。细胞内DNA损伤存在多种类型，其中DNA双链断裂(DNA double strand break，DSB)对细胞影响最为严重，对细胞生存是致命的。通过在肿瘤细胞中产生DNA损伤，诱导肿瘤细胞周期中止、坏死和凋亡是临床放、化疗的主要目的。但细胞中DNA损伤修复路径的存在，削弱了肿瘤细胞对治疗的敏感性。组蛋白去乙酰化酶是目前抗肿瘤治疗的新靶点，有研究证明，其抑制剂能够有效抑制肿瘤细胞内受损DNA修复，大幅提高肿瘤细胞对放、化疗的敏感性，而对人正常细胞影响较小。本研究通过Ⅱ型DNA拓扑异构酶抑制剂，依托泊苷(Etoposide)在乳腺癌MCF-7细胞中诱导产生DSB损伤，探索组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA对肿瘤细胞DSB路径的影响，初步研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂对DSB修复通路的作用机制，并用流式细胞术检测SAHA对同源染色体指导的重组修复路径(homologous direct recombination，HDR)的抑制效率，为高效抗肿瘤药物的开发提供实验依据。
　　 方法：利用Ⅱ型DNA拓扑异构酶抑制剂Etoposide(VP-16)，在乳腺癌细胞MCF-7中诱导DSB损伤产生，免疫荧光检测DSB损伤标志物-磷酸化变异组蛋白H2A(histone variant H2A phosphorylated at serine139，γ-H2Ax)的生成。DNA琼脂糖电泳，观察VP-16作用MCF-7细胞后基因组DNA断裂产生的涂抹状Smear条带形成，佐证DSB损伤的存在。细胞克隆形成实验观察SAHA对VP-16诱导的DSB损伤修复的影响。使用CCK-8试剂盒检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA对肿瘤细胞MCF-7及人正常细胞HEK293的细胞增殖毒性作用。Real-TimePCR检测SAHA的加入，对DSB修复相关基因mRNA表达的影响，Western-Bloting检测SAHA对DSB修复蛋白在染色体结合蛋白水平上的改变。流式细胞仪定量检测SAHA对HDR路径修复效率的改变。
　　 结果：⑴DNA拓扑异构酶抑制剂Etoposiden(VP-16)可在MCF-7细胞中有效诱导产生DSB损伤。⑵组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA可抑制MCF-7细胞内DSB修复能力，但SAHA对人正常细胞HEK293无显著抑制作用，并且这一现象与SAHA抑制HDR及C-NHEJ路径关键修复基因rad51、kuS0、rpa70的mRNA水平表达，下调修复蛋白Rad51、Ku80、RPA70在染色体损伤位点结合能力相关。⑶流式细胞仪检测SAHA对MCF-7细胞中HDR路径修复效率抑制呈剂量依赖，0.5μM、1.5μM及4.5μM药物可使HDR路径修复效率分别下降9.9％、42.3％和64.7％
　　 结论：①乳腺癌MCF-7相对于人对正常细胞HEK293细胞，对SAHA的细胞毒性作用更为敏感。②SAHA可下调HDR及C-NHEJ路径关键修复基因rad51、ku80、rpa70的mRNA水平表达，并干扰修复蛋白Rad51、Ku80、RPA70结合于染色体损伤位点。③组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA可以有效抑制MCF-7细胞DSB修复能力，且呈剂量依赖性，而SAHA对人正常细胞HEK293无显著抑制作用。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 在MCF-7细胞中诱导DNA双链断裂损伤模型及鉴定

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

3．流式细胞术定量SAHA对HDR路径修复效率的影响

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

4．流式细胞术定量SAHA对HDR路径修复效率的影响

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

小结

参考文献

综述 组蛋白去乙酰化酶抑制剂对DNA双链断裂修复路径的作用

致谢

附录一 缩写词对照

附录二：硕士在读期间科研情况