柑橘木虱对杀虫剂敏感性检测及抗药性相关基因分析

摘要

柑橘木虱是柑橘毁灭性病害柑橘黄龙病的传播媒介。化学控制柑橘木虱是遏制柑橘黄龙病扩散蔓延的有效途径之一。然而，由于长期不合理的使用杀虫剂使得柑橘木虱对一些常用杀虫剂产生了抗药性。在中国、美国及全球其他柑橘产区均有柑橘木虱抗药性的报道。因此，针对抗药性的研究可为高效防控柑橘木虱指明方向。拟除虫菊酯是一类作用于昆虫神经系统的杀虫剂，能有效控制卫生害虫以及农业害虫。该类杀虫剂的作用靶标为节肢动物的钠离子通道，是一种在兴奋性细胞中起始并传递动作电位的跨膜蛋白。拟除虫菊酯优先与开放状态的钠离子通道结合并使通道张开的状态延长，从而使昆虫瘫痪并不久死亡。钠离子通道的非同义突变会降低昆虫对拟除虫菊酯的敏感性。同时，钠离子通道可变外显子的组合也会影响昆虫对拟除虫菊酯的敏感性。转录组学是研究功能基因的一种方法，其已广泛应用于多个领域。利用它高通量的特性，可以获得研究所需要的重要的基因。据此，本学位论文以柑橘木虱为研究对象，在明确其田间种群对常用药剂敏感性水平的基础上，测定了寄主植物对其体内解毒代谢酶活性的影响，克隆获得了柑橘木虱的钠离子通道基因的序列并预测了与抗药性有关的突变位点，系统分析了钠离子通道基因可变外显子的组合及其在不同生长发育阶段的频率，最后利用转录组学方法挖掘出柑橘木虱与抗药性相关基因，主要研究结果如下：
　　1美国佛罗里达州柑橘木虱对杀虫剂敏感性检测
　　采用生物测定的方法系统监测了美国佛罗里达州5个县的柑橘木虱田间种群对7种常用杀虫剂的敏感性水平。结果表明，不同地区柑橘木虱对药剂的敏感性差异很大。Lake Alfred的柑橘木虱对甲氰菊酯的敏感性显著低于Winter Garden的柑橘木虱。La Belle地区的柑橘木虱对西维因、乐果和噻虫嗪的敏感性显著低于Fort Pierce的柑橘木虱。Fort Pierce地区的柑橘木虱对吡虫啉的敏感性显著低于La Belle的柑橘木虱。Winter Garden地区柑橘木虱对噻虫嗪的敏感性显著低于Fort Pierce的柑橘木虱。总体来看，柑橘木虱对杀虫剂敏感性下降说明这些地区柑橘木虱有潜在发展为抗性的风险。
　　2寄主植物对柑橘木虱主要解毒代谢酶活性的影响
　　采用离体酶活性测定的方法，分析了柑橘木虱分别饲养于3种寄主植物12代后其体内的酯酶（EST）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和P450的活性。结果表明，饲养于千里香上柑橘木虱的P450活性显著高于饲养于夏橙和九里香上的柑橘木虱的P450活性，且后两者之间没有显著差异。饲养于3种寄主植物上的柑橘木虱体内的EST活性均没有明显差异。饲养于千里香和九里香上的柑橘木虱体内的GST活性显著高于以夏橙为寄主饲养的柑橘木虱的GST活性，且前两者之间无显著性差异。测定柑橘木虱3个种群对甲氰菊酯的敏感性发现三者之间虽存在差异，但统计分析差异不显著，分析发现这种差异与酶活性的差异一致。因此，不同寄主植物可能影响柑橘木虱体内的解毒代谢酶活性。
　　3柑橘木虱钠离子通道的鉴定、分析及突变位点预测
　　克隆获得了柑橘木虱钠离子通道基因的cDNA全长序列。结合生物信息学分析和实验验证，明确了柑橘木虱的钠离子通道基因的36个外显子。依据密码子使用规律分析发现，与昆虫抗药性相关的6个突变位点中，V410、M918和F1534是柑橘木虱最有可能发生突变的位点。同时在序列比对或克隆片段中鉴定出柑橘木虱钠离子通道的可变外显子j、i、a、b、f、k和l。
　　4柑橘木虱钠离子通道基因可变外显子的组合及其在不同生长发育阶段的频率
　　研究建立了一种新的可变外显子在单分子中组合的探测方法，并将该方法命名为Variant-detecting PCR。利用该方法测定了柑橘木虱66个钠离子通道单分子中可变外显子的组合，发现了13种可变外显子的组合。其中，可变外显子j在卵中频率最低，b在1龄幼虫时频率最高，可变外显子f则从1龄到5龄若虫的频率逐渐降低。
　　5柑橘木虱转录组组装、基因功能注释及抗药性相关基因挖掘
　　对柑橘木虱4个样本进行转录组组装，共成功组装58,059条Unigene。进一步的生物信息学分析表明，有20,191条Unigene得到功能注释。其中，与抗药性相关的基因包括细胞色素P450基因序列49条、 NADH脱氢酶基因序列46条、谷胱甘肽S-转移酶基因序列16条、羧酸酯酶基因序列16条、钙通道基因序列14条、过氧化氢酶基因序列9条、氯通道基因序列9条、GABA受体相关基因序列2条、ABC转运蛋白相关基因序列84条和鱼尼丁受体相关基因序列2条。
　　综上所述，美国佛罗里达州柑橘木虱对杀虫剂敏感性有不同程度的降低，存在抗性产生的风险，说明对柑橘木虱的管理需要实时监控其抗药性水平，为科学用药提供依据。柑橘木虱的寄主植物可能影响其体内的解毒代谢酶进而影响其对杀虫剂的敏感性，因此柑橘木虱的抗药性管理需要考虑寄主植物等因素。昆虫对拟除虫菊酯产生抗药性往往由钠离子通道基因多个点突变引起，且这些突变有叠加效应。如果在生物测定中未发现显著的抗性，则可以通过检测钠离子通道的突变位点确定柑橘木虱是否对拟除虫菊酯类杀虫剂存在抗性的风险。柑橘木虱钠离子通道的鉴定和突变位点的预测为今后在分子水平上快速检测田间柑橘木虱抗拟除虫菊酯类杀虫剂提供了技术储备。柑橘木虱不同发育阶段钠离子通道可变剪切的研究为其对拟除虫菊酯和其他杀虫剂抗药性机理研究提供了更多信息。柑橘木虱转录组的研究鉴定了柑橘木虱抗药性相关基因为深入研究柑橘木虱的抗药性分子机理奠定基础。

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第1章 文献综述

1柑橘木虱

2柑橘木虱的抗药性

3 寄主植物对昆虫的影响

4昆虫抗药性的分子机理

5钠离子通道

6高通量测序与转录组

引言

1.1 研究目的

1.2研究内容

1.3预期结果与意义

1.4 技术路线

第2章 柑橘木虱田间种群对7种杀虫剂的敏感性检测

1 材料与方法

2结果与分析

3结论与讨论

第3章 三种寄主植物对柑橘木虱主要解毒代谢酶活性的影响

1材料与方法

2 结果与分析

3结论与讨论

第4章 柑橘木虱钠离子通道基因鉴定及突变位点预测

1材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第5章 柑橘木虱钠离子通道基因可变剪切的组合方式及频率检测

1 材料与方法

2结果与分析

3 结论与讨论

第6章基于转录组的柑橘木虱抗性相关基因发掘

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第7章 主要结果和结论、创新点及研究展望

1 主要结果和结论

2 创新点

3 研究展望

参考文献

致谢

附件1.攻读博士期间发表论文目录