犬弓首蛔虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1的表达、分布及功能研究

摘要

犬弓首蛔虫（Toxocara canis）是弓首科、弓首属的一种寄生线虫，主要经口、胎盘等途径感染犬、狐等多种动物。T.canis感染性幼虫进入终末宿主体内后经内脏移行过程最终在肠道内发育为成虫，但当进入非特异性宿主体内时，感染性幼虫不能发育为成虫，而是移行到宿主内脏、肌肉、神经系统等部位，成为滞育的感染性幼虫。人及多种动物意外摄食T.canis感染性虫卵或未煮熟的肉/内脏中的感染性幼虫可感染该寄生虫。多数人感染T.canis后无明显的症状，但会出现内脏幼虫移行症（visceral larva migrans,VLM），眼睛幼虫移行症（ocularlarva migrans,OLM）以及隐性弓首蛔虫病（covert toxocariasis/common toxocariasis,CT）。长期慢性的T.canis感染还会侵害神经系统，造成神经弓首蛔虫病（neurological toxocariasis,NT）。弓首蛔虫感染可能会促进呼吸系统疾病（哮喘和肺纤维化）、过敏性疾病（慢性瘙痒和荨麻疹）以及神经系统疾病（认知障碍以及癫痫、精神分裂、痴呆、帕金森综合征）的发生，引起了人们的极大关注。流行病学调查表明，弓首蛔虫病呈世界性分布，以热带、亚热带地区流行情况最为严重。目前，弓首蛔虫病的诊断仍存在敏感性低，特异性不高等缺点，药物治疗难以有效清除体内移行的幼虫，亟需新的诊断及防治策略来控制该病。
　　磷酸化/去磷酸化是蛋白质功能转录后调节的主要机制。丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（serine/threonine phosphatases,STPs）是真核生物体内转录后水平去磷酸化作用的重要执行者。根据氨基酸序列同源性、三维结构以及对抑制剂的敏感性，STPs被划分为磷酸蛋白磷酸酶（phosphoprotein phosphatases,PPPs），镁依赖性蛋白磷酸酶（protein phosphatases magnesium dependent,PPMs）和酪氨酸蛋白磷酸酶（protein tyrosine phosphatases,PTPs）3个家族。STPs在寄生虫的生长、发育、繁殖、细胞信号转导等生物学过程中发挥重要的作用。丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1（serine/threonine protein phosphatase1,PP1）是PPPs家族的重要成员，在真核生物中参与细胞分裂、蛋白质合成、细胞骨架重组和信号传导等多种细胞生物学过程的调节。在寄生虫中，PP1还参与对宿主细胞的吸附、侵袭以及增殖或繁殖等活动，是潜在的药物靶点。国内外尚无对T.canisSTPs的报道。
　　本研究克隆了Tc-stp-1全长基因，对TcPP1的组织分布和TcPP1的亚细胞分布情况进行了研究，利用RNA干扰技术对Tc-stp-1基因功能进行了探讨，试验结果总结如下：
　　1.犬弓首蛔虫Tc-stp-1基因的克隆及序列分析
　　采用5’RACE技术扩增了Tc-stp-1全长基因，序列长度为1192 bp，含有完整的编码区序列（coding sequence,CDS）942 bp，5’端非翻译区（untranslated regions,UTR）和3’UTR。Tc-stp-1基因编码312个氨基酸残基（amino acid residues,aa），其金属离子结合位点为G61、Y67、D93、T125、L175、V250，活性位点为G61、Y67、D93、T125、S126、L175、V250。多重序列分析表明 Tc-stp-1编码的氨基酸序列与罗阿丝虫（Loa loa）、布鲁马来丝虫（Brugia malay）、猪蛔虫（Ascaris suum）、有齿食道口线虫（Oesophagostomum dentatum）、捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）以及毛圆线虫（Trichostrongylus vitrines）的PP1氨基酸序列在GDXHG、GDXVDRG、GNHE等基序处完全保守，但序列两端差异较大。系统发育分析表明Tc-stp-1编码的氨基酸序列与L.loa和B.malayi的PP1催化亚基（PP1 catalytic subunit,PP1c）的氨基酸序列相似性最高。结构和功能预测结果显示，Tc-stp-1编码的蛋白质为TcPP1cα，其结合位点为D90、R94、N122、H123、R220、H247，分子功能为信号转导（GO:0004871），生物学过程为蛋白去磷酸化（GO:0006470），细胞组分为细胞质（GO:0005829）。
　　2.TcPP1cα的原核表达及多克隆抗体的制备
　　本研究克隆了Tc-stp-1完整CDS序列，构建了Tc-stp-1/pET28a（+）重组表达质粒，测序结果显示载体插入序列长度为948 bp（包括酶切位点识别序列）。利用Escherichia coli BL21（DE3）原核表达系统进行了重组蛋白TcPP1cα的外源表达，SDS-PAGE电泳结果表明，重组TcPP1cα以包涵体形式表达，大小约为30 KD。对表达条件进行优化后，以0.4 mM IPTG诱导，在37℃培养条件下获得大量包涵体形式目的蛋白。采用镍离子亲和层析（Ni-NTA）技术纯化目的蛋白，以1M咪唑洗脱时获得高纯度目的蛋白，制备了兔抗TcPP1cα多克隆抗体。经检测，该兔抗TcPP1cα多克隆抗体蛋白浓度0.51 mg/mL，滴度>1:256000，纯度高于95％。免疫印迹（Western blot）试验结果显示条带单一，表明兔抗TcPP1cα多克隆抗体的特异性好。
　　3.Tc-stp-1的特异性表达和TcPP1cα的特异性分布
　　利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）技术对Tc-stp-1在T.canis雌虫、雄虫以及虫体各组织中的转录情况进行了研究，结果表明Tc-stp-1在T.canis雄虫中特异性表达，其中雄虫输精管中Tc-stp-1的转录水平最高，精巢中Tc-stp-1的转录水平次之。同时，利用兔抗TcPP1cα多克隆抗体，采用间接荧光免疫组织化学技术（indirect fluorescence immunohistochemical analysis）对TcPP1cα在雄虫各组织的分布情况进行了研究，结果显示TcPP1cα特异性地分布于雄虫生殖组织，且主要集中于精巢和输精管，以及精巢和输精管中的各阶段精细胞。Tc-stp-1在T.canis雄虫生殖组织中的特异表达以及TcPP1cα在雄虫生殖组织的分布表明Tc-stp-1可能参与T.canis的繁殖相关过程。
　　4.TcPP1cα的亚细胞分布
　　本研究克隆了Tc-stp-1完整CDS序列，构建了Tc-stp-1/pSL1180重组表达质粒，测序结果显示载体插入序列长度为950 bp（包括酶切位点识别序列）。利用sf9细胞真核表达系统进行了重组蛋白TcPP1cα的外源表达，采用间接荧光免疫细胞化学技术（indirect fluorescenceimmunocytochemical analysis）检测了TcPP1cα重组蛋白在sf9细胞中的分布情况。结果表明，TcPP1cα重组蛋白分布于分裂间期sf9细胞的细胞质和分裂期sf9细胞的纺锤体中间位置（赤道板）。TcPP1cα的亚细胞分布表明Tc-stp-1可能参与T.canis的细胞分裂过程。
　　5.Tc-stp-1的RNA干扰研究
　　采用双链RNA介导的干扰技术（double-stranded mediated RNA interference,dsRNAi）阻断Tc-stp-1基因的转录－表达的过程，利用 qRT-PCR技术进行了Tc-stp-1基因敲低（gene knock down）分析。结果显示，干扰24 h后，T.canis精巢和输精管中的Tc-stp-1转录水平明显降低；干扰48 h后，贮精囊中的Tc-stp-1转录水平明显下降，输精管中的Tc-stp-1转录水平回升；干扰72 h后，精巢和贮精囊中的Tc-stp-1转录水平回升，输精管中的Tc-stp-1转录水平超过对照组水平。组织切片显微观察发现，干扰24h后，T.canis贮精囊和输精管中的精细胞形态异常；干扰48h后，输精管中的精细胞减数分裂出现异常；干扰72h后，输精管中异常的精细胞减数分裂过程恢复正常。Tc-stp-1基因敲低试验导致的T.canis精细胞减数分裂异常，表明Tc-stp-1可能通过调节着丝点和纺锤丝的相互作用参与T.canis精细胞的生成、分裂和成熟等生物学过程，是潜在的药物靶点。

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第一章 文献综述

1.1 寄生线虫的性别和生殖研究概况

1.2 寄生线虫性别相关基因

1.3 寄生线虫性别相关基因功能研究方法

1.4 结论与展望

第二章 引言

2.1 研究背景及意义

2.2 主要研究内容

2.3 试验技术路线

第三章 犬弓首蛔虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1基因的克隆及序列分析

3.1 材料与方法

3.2 试验结果

3.3 分析与讨论

第四章 犬弓首蛔虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1的原核表达及多克隆抗体的制备

4.1 材料与方法

4.2 试验结果

4.3 分析与讨论

第五章 犬弓首蛔虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1的组织分布研究

5.1 材料与方法

5.2 试验结果

5.3 分析与讨论

第六章 犬弓首蛔虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1的亚细胞定位研究

6.1 材料与方法

6.2 试验结果

6.3 分析与讨论

第七章 犬弓首蛔虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1基因的RNA干扰研究

7.1 材料与方法

7.2 试验结果

7.3分析与讨论

第八章 全文总结与结论

全文总结

结论

参考文献

附录

在学期间发表论文及参与课题

致谢