基于信号放大的高灵敏腺苷与MicroRNAs电化学生物传感器的制备及研究

摘要

电化学生物传感是以生物分子作为识别元件，结合电化学检测技术，具有设备简单、灵敏度高、选择性好、响应速度快等特点的一类新型检测装置，近年来，被广泛应用于疾病诊断、药物分析、环境监测以及食品分析等领域。实际分析应用中，被分析物的浓度通常非常低，为了迎接这一挑战，迫切地要求研究者们采用各种信号放大策略来提高检测方法的灵敏度。因此，该论文从简化操作步骤出发，致力于设计不同的信号放大方法，构建了一系列高灵敏腺苷与MicroRNAs的电化学生物传感器，并对其相应原理及性能进行了全面深入的探究。主要研究工作归纳如下：
　　1.基于目标物诱导链释放与纳米金信号放大策略检测腺苷的电化学适体传感器研究
　　该实验基于目标物诱导链释放与纳米金(AuNP)信号放大策略，构建了一个高灵敏、强特异性的腺苷电化学生物传感器。目标物腺苷与生物素标记的腺苷适体链(biotin-ABA)的特异性结合，诱导巯基修饰的信号探针(SH-SP)从双链体(biotin-ABA/SH-SP)中释放出来。通过碱基互补配对，释放出的信号探针与固定在金电极上的捕获探针(SH-CP)杂交，从而被捕获到电极表面。利用Au-S键作用将纳米金固定到巯基化的信号探针上。这些固定的纳米金进一步组装大量的电活性物质—硫堇，导致显著放大的电流响应，从而实现高灵敏检测腺苷，检测限达到0.05nmol/L。此外，由于适体识别的高特异性，该方法对腺苷和其他类似的干扰分子展现了良好的选择性。重要的是，通过改变相应的适体识别链，该方法能提供一个更广阔的传感平台，以实现对各种类型的生物分子(蛋白质，细胞，氨基酸等)的低浓度检测。
　　2. DNA为模板原位合成的银纳米簇用以超灵敏且免标记的电化学MicroRNA检测
　　基于采用富胞嘧啶(cytosine,C)环状DNA为模板原位合成的银纳米簇(AgNCs)作为信号标记物，该体系构建了一个免标记、超灵敏的电化学检测microRNA(miRNA-199a)的传感方法。目标miRNA-199a与模板DNA杂交形成局部双链探针，触发目标物辅助聚合-剪切反应(TAPNR)，从而产生大量的中间体DNA片段，这些中间体DNA片段能够被固定在传感电极表面的DNA捕获探针捕获。被捕获的中间体DNA片段进一步触发以杂交链式反应(HCR)进行的自组装，从而在电极表面形成含有大量富C环的双链DNA(dsDNA)聚合体。再分别依次孵育AgNO3和硼氢化钠溶液于dsDNA聚合体改良的电极，实现以 DNA为模板原位合成AgNCs。由于将TAPNR与HCR双重信号放大策略统一于一体，原位合成AgNCs的量得到明显的增加，导致显著增强的电流响应，从而实现对miRNA-199a的高灵敏检测，其检测限达到0.64fmol/L。此外，构建的方法对目标miRNA-199a具有高选择性。由于具有高灵敏度与免标记的特征，该传感方案为实现不同目标microRNAs灵敏的、选择性的检测提供了新的思路。
　　3.基于癌细胞中多组分MicroRNA检测的电化学传感器的研究
　　在各种癌症早期诊断中，MicroRNA表达水平的测定扮演着一个重要的角色。基于对不同电位的氧化还原标记物和双链体特异性核酸酶(DSN)辅助的目标物循环信号放大方法的联用，该体系构建了一种用于多组分、高灵敏检测microRNA-141和microRNA-21的电化学传感器。该传感器由硫醇改性的、氧化还原物质标记的发夹型探针在金传感电极上自组装构成。目标microRNAs与固定在电极表面的探针杂交形成RNA/DNA双链体，与此同时，DSN紧接着裂解RNA/DNA双链体中氧化还原物质标记的发夹型探针，促使目标microRNAs循环利用，从而导致不同电位处显著减小的电流输出，最终实现对microRNA-141和microRNA-21多组分测定，其最低检测分别为4.2fmol/L和3.0fmol/L。该传感器对目标microRNAs具有高选择性，并且可以用于同时检测来自人类前列腺癌(22Rv1)和乳腺癌(MCF-7)细胞裂解液中的microRNAs。理论上来说，通过选择不同的氧化还原标记物，该方案对开发一个同时多组分检测其他RNA提供了一种新思路，且在临床应用中具有巨大的潜力。

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第一章 绪 论

1.1 电化学生物传感器

1.2 电化学生物传感器信号放大方法

1.3 本文研究思路

第二章 基于目标物诱导链释放与纳米金信号放大策略检测腺苷的电化学适体传感器研究

2.1 前言

2.2 试验部分

2.3. 结果与讨论

2.4 结论

第三章 DNA为模板原位合成的银纳米簇用以超灵敏且免标记的电化学MicroRNA检测

3.1 前言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 结论

第四章 基于癌细胞中多组分MicroRNA检测的电化学传感器的研究

4.1 前言

4.2．实验部分

4.3．结果与讨论

4.4 结论

参考文献

在学期间所发表的论文

致谢