E.tenella感染对雏鸡ChIL-17及相关细胞因子表达的影响

摘要

鸡球虫病(Coccidiosis)是严重危害养禽业发展的胞内寄生原虫病，主要激发产生以细胞免疫为主的免疫应答。IL-17家族细胞因子主要由Th17细胞分泌，在许多感染性疾病、自身免疫性疾病和炎症性疾病中发挥重要作用。目前针对IL-17在疾病感染中的作用研究多是以哺乳动物为对象，有关球虫感染对ChIL-17家族细胞因子表达的影响报道较少。本课题通过建立人工感染E.tenella模型，以实时荧光定量PCR技术为手段，检测E.tenella感染后不同时间点雏鸡盲肠扁桃体和脾脏ChIL-17A、ChIL-17F、ChIL-17RA及相关细胞因子表达动态变化，初步探讨了E.tenella感染对ChIL-17家族细胞因子表达的影响，主要研究结果如下：
　　1.人工感染E.tenella模型的建立
　　为建立适合后续试验的人工感染E.tenella模型，分别用1×104、5×104、10×104、15×104个/只E.tenella孢子化卵囊口服接种14日龄雏鸡，并记录不同剂量组雏鸡在接种后的临床表现、血便记分和病变值等指标。结果显示，接种剂量为5×104的雏鸡临床症状明显，死亡率为10％，粪便排出卵囊数多，相对增重率和病变值居中，所建立的模型可用于检测E.tenella感染后ChIL-17及相关细胞因子的表达水平。
　　2.雏鸡ChIL-17及相关细胞因子表达水平实时荧光定量PCR检测方法的建立
　　本试验自主设计或引用文献中ChIL-17及相关细胞因子的引物序列，建立检测它们表达水平的实时荧光定量PCR方法。结果显示，扩增的所有基因目的片段大小与预期相符；建立的实时荧光定量PCR方法溶解曲线均呈单峰，其溶解温度在82.5℃~88℃之间；标准曲线稀释度均为6个点以上，相关系数为0.982~1.000，斜率为-3.129~-3.299；PCR扩增效率为101.0%~108.7%；变异系数均小于2.5%，全部符合实时荧光定量PCR检测技术要求。表明所建立的实时荧光定量PCR方法稳定性好、可靠性高、特异性强，可作为后续试验研究E.tenella感染对ChIL-17A、ChIL-17F和ChIL-17RA及相关细胞因子的表达影响的技术检测方法。
　　3. E.tenella感染对雏鸡ChIL-17A、ChIL-17F及ChIL-17RA表达的影响
　　为研究E.tenella感染后雏鸡盲肠扁桃体和脾脏ChIL-17A、ChIL-17F及ChIL-17RA表达情况，用E. tenella孢子化卵囊（5×104个/只）口服感染14日龄非免疫小公鸡，于0h、2h、4h、6h、12h、24h、3d、5d、7d九个不同时间点分别同时提取对照组和试验组雏鸡盲肠扁桃体和脾脏总RNA，采用实时荧光定量PCR方法检测两种组织中三个基因的表达水平。盲肠扁桃体各基因检测结果显示，ChIL-17A的表达水平在感染后持续下调，感染后3d达到最低水平，仅为感染前（0h）的0.0097倍(P＜0.01)；而ChIL-17F在感染早期明显上调，感染后2h和4h分别上调3.07倍（P＜0.05）和6.49倍（P＜0.01），与ChIL-17A表达变化相反；ChIL-17RA于感染后24h和7d分别上调1.73倍和2.21倍（P＜0.01）。脾脏各基因检测结果显示，ChIL-17A表达水平稍微下调，无显著差异，但在感染后7d上调为感染前（0h）的2.71倍（P＜0.05）；ChIL-17F感染后2h表达水平降低为0h的0.13倍（P＜0.01），6h上调为0h的1.81倍（P＜0.01），随后在24h和7d两个时间点分别下调为0h的0.21倍（P＜0.01）和0.38倍（P＜0.05）；ChIL-17RA仅在2h检测到其表达下调0.60倍（P＜0.05），其余时间点的表达水平无显著差异。结果表明盲肠扁桃体和脾脏ChIL-17A、ChIL-17F及ChIL-17RA都参与了雏鸡抗E. tenella感染的反应，其中盲肠扁桃体ChIL-17A和ChIL-17F在感染早期（2h~4h）的相反表达动态说明二者在雏鸡防御E.tenella感染的早期具有不同的免疫调节功能，而这一具体调节机制还有待进一步的研究加以阐明。
　　4. E.tenella感染对雏鸡其它相关细胞因子表达的影响
　　为探究ChIL-17与其它相关细胞因子之间的相互作用，针对性的选择由Th1和Th2细胞分泌且与IL-17分化相关的IL-6、IFN-γ、GM-CSF以及IL-12四个相关细胞因子进行E.tenella感染后表达变化的检测。结果显示，E.tenella感染后2h，盲肠扁桃体GM-CSF和IL-12分别上调2.96倍(P＜0.01)和18.63倍(P＜0.01)；感染后4h，盲肠扁桃体IL-6表达水平上调(P＜0.01)，IL-12表达水平持续上调到峰值，为0h的133.95倍(P＜0.01)，脾脏IL-6、GM-CSF和IL-12表达水平急剧上调至峰值，表达水平分别为0h的9.65倍、340.19倍和119.83倍(P＜0.01)；随后6h和12h两个时间点中，盲肠扁桃体和脾脏IL-6、IFN-γ以及IL-12表达水平无显著差异，盲肠扁桃体GM-CSF持续下调表达；感染后24h，脾脏IL-6上调为0h的3.14倍(P＜0.05)；感染后第3d和第5d，盲肠扁桃体GM-CSF依然稳定的下调表达(P＜0.05)，而脾脏IFN-γ表达水平分别上调为0h的391.08倍和138.28倍(P＜0.01)，盲肠扁桃体IFN-γ在第5d时上调为0h的6.31倍(P＜0.01)，达到上调高峰；感染后第7d，盲肠扁桃体IL-6达到上调高峰，表达水平上调为0h的4.91倍(P＜0.01)。结果表明，雏鸡IL-6、IL-12、IFN-γ和GM-CSF都参与了抗E.tenella感染的免疫反应。IFN-γ在感染后期表达水平上调，GM-CSF表达下调，表明在雏鸡抗E.tenella感染后期，介导细胞免疫的Th1型细胞因子发挥着主导作用。
　　总之，本研究用5×104个/只E.tenella孢子化卵囊接种雏鸡以建立人工感染模型，检测感染后ChIL-17及其它相关细胞因子的表达变化。结果表明，ChIL-17A、ChIL-17F及ChIL-17RA都参与了雏鸡抗E.tenella感染的反应；推测Th17细胞介导的炎症反应和Th1介导的细胞免疫反应是雏鸡抗E.tenella感染的主要免疫应答反应类型。Th17细胞分泌的ChIL-17主要参与宿主早期抗E.tenella感染的炎症反应；随着时间的推移和感染的发展，Th1型细胞因子IFN-γ表达水平极显著上调，宿主的免疫反应向Th1型偏移，同时抑制Th2型细胞因子的分泌从而使GM-CSF表达下调。

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第一章 文献综述

1.1 鸡球虫病概述

1.2细胞因子与鸡球虫的感染与免疫

第二章 前 言

第三章 人工感染E. tenella模型的建立

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 试验结果

3.4 分析与讨论

3.5 结论

第四章 雏鸡ChIL-17及相关细胞因子表达水平实时荧光定量PCR检测方法的建立

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3 试验结果

4.4 分析与讨论

4.5 结论

第五章 E. tenella感染对雏鸡ChIL-17A、ChIL-17F及

5.1 试验材料

5.2 试验方法

5.3 试验结果

5.4 分析与讨论

5.5 结论

第六章 E. tenella感染对雏鸡相关细胞因子表达的影响

6.1 试验材料

6.2 试验方法

6.3 试验结果

6.4 分析与讨论

6.5 结论

第七章 全文结论及创新点

7.1 全文结论

7.2 创新点

参考文献

致谢

攻读硕士期间论文发表情况