魔芋耐热性鉴定及热激蛋白HSP基因的克隆与初步分析

摘要

魔芋（Amorphophallus rivieri）喜温不耐热，高温是影响其产量和品质的主要非生物胁迫因素之一。在我国西南主要魔芋种植区域，特别是川渝芋区，周期性的热害常有发生，因此，筛选耐热种质资源、选育耐热新品种尤为重要。种质材料的耐热性鉴定是魔芋耐热育种的基础，然而目前我们对魔芋耐热的生理机制、分子机制及互作调控机理的细节知之甚少。本研究根据前人对魔芋田间农艺性状的观察结果，选取耐热性差异明显的3个魔芋种为实验材料，分别从生理生化和分子生物学两方面研究了魔芋耐热的生理基础与调控机制，以期为进一步研究魔芋耐热因子表达调控和功能分析奠定基础。
　　本实验以耐热性明显不同的白魔芋（Amorphophallus albus，Aa）、花魔芋（Amorphophallus konjac，Ak）和珠芽魔芋（Amorphophallus bulbifer，Ab）为试材。通过测定43℃高温胁迫下叶片生理生化指标含量的变化、观察叶片微观组织结构以及统计热害指数的变化，掌握了高温胁迫下3种魔芋试材主要耐热指标的变化规律，明确了不同魔芋种耐热性强弱以及筛选能有效反映魔芋耐热性差异的指标，探讨了魔芋耐热的生理机制；利用已经公开的耐热相关热激蛋白基因同源序列设计引物，克隆了3种魔芋材料热激蛋白基因sHSP、HSP70和HSP90，并根据已测序序列设计半定量RT-PCR引物，研究了不同时间高温胁迫下sHSP、HSP70和HSP90在魔芋叶片中的表达情况。主要研究结果如下：
　　1．魔芋的耐热性鉴定
　　利用耐热性差异明显不同的白魔芋、花魔芋和珠芽魔芋试材，测定了43℃高温胁迫下不同魔芋叶片相关耐热指标。结果表明，高温处理后，Aa叶片中CAT活性、SP和Pro含量的大小和增幅均大于Ak和Ab，Ab居中，Ak最小；Ak叶片中REC和MDA含量的大小和增幅最高，Ab居中，Aa最小；高温处理6h、18h和24h，Aa叶片中SOD和APX活性及增幅均显著大于Ab和Ak；高温处理6h后，Aa叶片中SS含量及增幅显著高于Ab和Ak。同时高温胁迫过程中，Aa叶片中Pn、Tr、Chl a/b的大小和降幅均大于Ab和Ak，处理1d、2d和4d的叶片中Gs和Ci大小依次是Aa、Ab和Ak。供试材料在高温胁迫过程中，Aa叶片的气孔密度和开度大于Ab和Ak，其叶肉细胞受到高温胁迫的影响和损伤也最低，处理4d后，热害指数差异显著，Aa最低，其次是Ab和Ak。表明CAT、SP、Pro、REC、MDA、Chl a/b、Pn、Tr、微观组织结构和热害指数十个耐热指标的变化规律能够准确反映魔芋耐热性差异，可用于耐热性鉴定，3种供试材料的耐热性强弱依次是白魔芋Aa、珠芽魔芋Ab和花魔芋Ak。POD活性指标在高温胁迫下变化复杂，与各种间耐热性无显著相关。
　　2．魔芋HSP基因的克隆与序列分析
　　以白魔芋、花魔芋和珠芽魔芋为试材，通过同源克隆法获得AasHSP、AksHSP和AbsHSP基因片段大小均为468bp，包含全长开放阅读框，编码155个氨基酸残基。生物信息学方法分析表明，蛋白分子量分别为17.284、17.270和17.095kDa；等电点为6.84、6.84和6.31；氨基酸序列C端均含有典型的ACD保守结构域；与半夏PtsHSP的亲缘关系最近。同源克隆法获得AaHSP70、AkHSP70和AbHSP70基因片段大小分别为1944bp、1947bp和1944bp，包含全长开放阅读框，各自编码647、648、647个氨基酸残基。生物信息学分析表明，蛋白分子量分别为71.069、71.054和71.023kDa；等电点为5.14、5.16和5.17；氨基酸序列N端均含有高度保守的NBD结构域；与芭蕉MaHSP70和棉花GrHSP70亲缘关系最近。同源克隆法获得AaHSP90、AkHSP90和AbHSP90基因片段大小均为2103bp，包含全长开放阅读框，编码700个氨基酸残基。生物信息学分析表明，蛋白分子量分别为80.036、80.056和80.188kDa；等电点为5.01、5.01和5.00；氨基酸序列N端均含有ATPase保守结构域；与芭蕉MaHSP90亲缘关系最近。
　　3．高温胁迫下HSP基因的半定量RT-PCR分析
　　以白魔芋、花魔芋和珠芽魔芋为试材，利用半定量RT-PCR技术分析了不同基因在高温胁迫不同时间下叶片表达情况。结果显示，感热种花魔芋AksHSP在热激0.5h后表达量迅速增加到最高值，而耐热种白魔芋AasHSP和珠芽魔芋AbsHSP基因热激响应时间较AksHSP长，在2h后达峰值，且AasHSP基因的表达峰值及表达总量均明显高于AksHSP和AbsHSP。感热种花魔芋AkHSP70在热激0.5h后表达量迅速增加到最高值，而白魔芋AaHSP70和珠芽魔芋AbHSP70基因热激响应时间较AkHSP70长，分别在2h和5h后达峰值，且AaHSP70基因的表达量明显高于其余二者。感热种花魔芋AkHSP90在热激0.5h后表达量迅速增加到最高值，而耐热性更强的白魔芋AaHSP90和珠芽魔芋AbHSP90基因热激响应时间较AkHS90P长，分别在2h和1h后达峰值，且AaHSP90基因的的表达峰值及表达总量均明显高于AkHSP90和AbHSP90。

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第一章 文献综述

1.1 魔芋概况

1.2 植物耐热性鉴定研究进展

第二章 引言

第三章 不同魔芋种质的耐热性鉴定

3.1 实验材料

3.2 实验设计

3.3 实验方法

3.4 结果与分析

3.5 讨论

第四章 魔芋热激蛋白HSP基因的克隆与半定量分析

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

在校期间发表的论文

在读期间参加的科研项目