组织HSP70介导HIFU消融胰腺癌后大鼠的T细胞免疫增强效应

摘要

背景：高强度聚焦超声(high-intensity focused ultrasound，HIFU)作为近年来新兴的局部肿瘤消融治疗手段得到人们的广泛关注，HIFU利用超声波良好的组织穿透性和方向性，将超声波能量聚焦到靶区肿瘤组织，产生的瞬间高温将靶区肿瘤形成凝固性坏死，在不损伤靶区外周围组织器官的同时达到治疗肿瘤的目的。
　　HSP70是热休克蛋白（heat shock protein，HSP）家族中最重要的成员之一，HSP70具有分子伴侣功能，参与抗原的合成、组装和呈递，并与抗原肽形成HSP-肽复合物，激活机体产生的特异性免疫应答。HSP70可参与体内多种免疫过程：HSP70作为免疫系统的外源性抗原，可以不经过专职抗原提呈细胞（Antigen presenting cell，APC）的处理，直接与APC细胞表面的MHC-II受体分子结合，活化CD4+T淋巴细胞，增强机体的免疫效应。HIFU消融靶区肿瘤后，局部肿瘤细胞在高温应激下大量表达HSP蛋白，同时会伴随着肿瘤细胞的死亡被释放到细胞外，HIFU消融产生的HSP蛋白是否具有生物活性，能否发挥抗原呈递作用进而激活T细胞免疫还有待进一步探究。
　　临床研究发现，HIFU治疗乳腺癌原发灶后，VEGF和CA125等肿瘤抗原在癌组织中大量表达[1]；肿瘤组织中的APC数量明显增多，主要组织相容性复合体MHC-II和共刺激分子表达上调。进一步研究发现，HIFU治疗乳腺癌后，靶区肿瘤组织中的肿瘤细胞的死亡明显增加，CD4+T细胞，CD8+T和NK细胞数目增多，T淋巴细胞的功能被激活，T细胞免疫效应增强[2]。上述研究结果表明HIFU治疗靶区肿瘤后，肿瘤坏死组织中的肿瘤抗原可能通过某些机制激活了机体的特异性抗原递呈的途径，机体的特异性抗肿瘤细胞免疫功能增强。
　　本课题前期研究发现，HIFU单独或者联合化疗药物治疗胰腺癌后，胰腺肿瘤缩小或者生长受到抑制，血糖代谢转归良好，机体的抗肿瘤免疫效应明显增强。本课题在此基础上，建立SD大鼠胰腺癌原位模型，通过12.0mHz高频B超筛选出肿瘤大鼠；HIFU消融SD大鼠胰腺癌后，观察局部组织中HSP70的表达与机体免疫效应的变化，探究HSP70对抗原呈递的影响和免疫效应增强的机制，为HIFU治疗胰腺癌在临床应用上提供有效的科学依据。
　　目的：通过将SD大鼠胰腺癌的高频B超与普通诊断B超的影像学特征进行对比分析，并结合病理组织学诊断，建立 SD大鼠胰腺癌的高频B超影像学诊断方法；通过分析HIFU消融后局部组织HSP70及抗原呈递相关MHC-II和ZAP70表达水平的变化和大鼠的外周血IL-2、IFN-γ水平和CD3+/CD4+T细胞数目的变化，探究HIFU消融SD大鼠胰腺癌后机体T细胞免疫效应和组织HSP70及其抗原传递相关因子变化的相关性。
　　方法：
　　1.用二甲基苯并蒽（7,12-dimethylbenz(a)anthracene,DMBA）诱导法建立大鼠胰腺原位癌模型，对照组为正常健康大鼠，分别利用12.0mHz高频超声和5.0mHz普通诊断超声对SD大鼠的不同体位进行横断面扫描，对比分析SD大鼠胰腺癌病灶12.0mHz高频超声和5.0mHz普通诊断超声的影像学特征，联合大鼠胰腺癌病理组织学判断胰腺肿瘤特性，建立大鼠胰腺癌高频B超影像诊断方法。
　　2.高频B超影像诊断筛选90只胰腺癌模型SD大鼠，将诊断出的患有胰腺癌的大鼠随机分为HIFU消融实验组和模型对照组，40只正常健康大鼠作为正常对照组。将高强度聚焦超声（功率为5w，声强为2500W/cm2）作用于实验组大鼠，采用点消融的方式，每次消融时间为5s，进行完全消融；模型对照组和正常组不做消融处理，其他处理完全相同。分别在消融后2h、4h、8h和12h取大鼠胰腺组织，采用免疫组化两步法和蛋白质印迹检测HSP70、MHC-II和 ZAP70在局部组织中的表达情况；分别在消融后1天、4天、7天和14天采用心脏取血的方法取大鼠的外周血，ELISA检测外周血IL-2和IFN-γ水平；采用密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞，流式细胞仪分析外周血CD3+/CD4+T细胞亚群的数量。
　　结果：
　　1.与正常组的大鼠相比，SD大鼠胰腺肿瘤在12.0mHz高频超声扫描影像中呈现低回声，形状较为规则，多为球形或者椭球形，肿瘤层次明显，与周围器官界限较为明显；SD大鼠胰腺癌在5.0mHz的诊断超声扫描下，未能发现明显的肿瘤低回声区，影像较为模糊；12.0mHz高频超声与5.0mHz诊断超声相比，高频B超扫描的胰腺肿瘤的影像更为清晰，肿瘤低回声区域更加明显；病理组织学显示SD大鼠胰腺肿瘤组织有大量的导管细胞增生并伴随着浸润性增长，呈现胰腺导管癌病理学特征。
　　2.HIFU消融SD大鼠胰腺癌后，外周血IL-2、IFN-γ水平和CD3+/CD4+T细胞亚群数量逐渐增高，消融4天后实验组大鼠外周血IL-2的水平（22.6±1.312）与对照组（17.37±0.872）相比差异显著（p<0.05），IFN-γ的水平在消融7天组（145.37±6.304）明显升高，与对照组（126.87±5.021）相比具有显著性差异（p<0.05）；CD3+/CD4+T细胞亚群数量在消融后7天（45.65±4.384）明显升高，与对照组（28.23±2.991）相比具有显著性差异（p<0.05）；HIFU消融后7~10天内大鼠外周血IL-2、IFN-γ水平和CD3+/CD4+T细胞亚群数量逐渐增加，接近正常组水平。
　　3.HIFU消融SD大鼠胰腺癌后，局部组织中HSP70、MHC-II和ZAP70的表达明显增加。与模型对照组（6.570±0.324）和正常对照组（6.362±0.650）相比，HIFU消融实验组中HSP70在消融4h的表达（32.570±1.173）明显增加，具有显著性差异（p<0.05），与正常组（6.543±0.547）相比，模型对照组（7.840±0.547）胰腺组织中也有少量HSP70表达，但不具有显著性差异（p>0.05）；HIFU消融4h组中局部组织MHC-II的表达（25.76±1.579）显著高于模型对照组（18.760±1.367）和正常组（20.768±1.324）（p<0.05），正常组MHC-II的表达高于模型对照组，但只在在2h和8h组具有显著性差异（p<0.05），HIFU消融后MHC-II的表达逐渐升高，在8h达到最高然后趋于稳定；对照4h组中ZAP70的表达（3.993±0.302）显著低于 HIFU消融实验组（16.80±0.472）和正常组（12.675±0.856）（p<0.05），与空白对照组相比，HIFU消融实验组 ZAP70的表达在2h（11.33±0.529）和4h（16.80±0.472）明显增加，具有显著性差异（p<0.05），在8h和12h时，两组ZAP70的表达无明显差异（p<0.05）。
　　结论：
　　1.DMBA诱导大鼠胰腺原位癌的形成；5.0mHz普通诊断超声扫描的SD大鼠胰腺癌的影像较为模糊，不能辨别胰腺肿瘤，12.0mHz高频超声扫描SD大鼠原位胰腺癌，肿瘤在超声影像下呈明显的低回声，肿瘤边界较为明显，影像更为清晰，12.0mHz高频B超扫描可以作为SD大鼠胰腺癌的影像学诊断方法。
　　2.HIFU消融SD大鼠胰腺癌后，靶区组织HSP70在短时间内大量表达，参与抗原递呈的MHC-II和ZAP70表达也明显增加，以及大鼠外周血IL-2和IFN-γ水平升高及其CD3+/CD4+T细胞亚群数目增加的迟发效应，提示机体的增强效应可能由组织HSP的抗原呈递途径介导。

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第一章 文献综述

1.1 HSP70在抗原呈递中的作用

1.2 HSP70在T细胞免疫中的作用

1.3 HSP70在肿瘤免疫的作用

1.4 HSP70与HIFU治疗

第二章 引言

第三章SD大鼠胰腺原位癌高频B超影像学特征

3.1 材料、试剂和仪器

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 HIFU消融大鼠胰腺癌后靶区组织HSP70介导的抗原递呈作用

4.1 材料、试剂和仪器

4.2 实验方法

4.3实验结果

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 HIFU消融胰腺癌后大鼠的T细胞免疫增强效应

5.1 材料、试剂和仪器

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 全文总结

参考文献

攻读硕士期间发表论文情况

致谢