灵菌红素抑制家蚕核型多角体病毒BmNPV核酸复制和基因表达的q-PCR分析

摘要

家蚕核型多角体病毒（BmNPV）属于杆状病毒科的一种环状双链超螺旋 DNA(dsDNA)病毒。根据感染进程的不同，BmNPV呈现出两种不同的病毒粒子表型，即芽殖病毒(budded virus，BV)和包涵体病毒(ODV)。BV依赖囊膜融合蛋白GP64引起细胞间的感染，而ODV形成于感染晚期，包埋于稳定的蛋白结晶体中，主要造成家蚕个体间的感染。BmNPV病毒基因的表达以DNA的复制为界限可分为两个时期，即早期和晚期，分别又可细分为极早期、早期、晚期和极晚期。研究显示，极早期基因ie-1、晚期基因vp39和极晚期基因p10可以被用作marker基因来评估BmNPV的增殖过程。灵菌红素是具有三个吡咯环的微生物次生代谢产物，具有多种生物学活性。本实验室前期的研究发现灵菌红素具抑制 BmNPV增殖的作用。本研究以此为出发点，进一步论证灵菌红素的抗 BmNPV病毒活性。
　　本研究主要内容包括：⑴收集病毒感染72h后的培养基上清，采用空斑法测定BmNPV子代病毒滴度。结果显示，灵菌红素能显著地抑制子代病毒BV的产生。对照组子代病毒BV的产生量显著高于灵菌红素处理组，分别为100 nM灵菌红素处理组和10 nM灵菌红素处理组BV产生量的105和103倍。通过显微计数的方法计算形成包涵体OB的细胞数。统计结果显示，灵菌红素能够影响病毒包涵体在细胞中的形成。随着灵菌红素浓度的增加，形成包涵体的细胞数逐渐减少，当灵菌红素浓度为100nM时，细胞中形成包涵体的细胞数仅为4.45％。⑵利用q-PCR检测灵菌红素对病毒基因组DNA复制的影响。实验结果表明，随着BmNPV感染时间的增加，对照组病毒DNA增加显著，而灵菌红素处理组病毒DNA增加较缓慢，总量远低于对照组。其中，BmNPV感染48h、72h和96h后，灵菌红素处理组病毒 DNA总量仅分别为对照组病毒DNA总量的3.0%、1.3%和5.7%。研究结果表明，灵菌红素可显著地抑制BmNPV病毒基因组DNA的复制。⑶采用qRT-PCR技术检测灵菌红素对BmNPV基因转录表达的影响。结果显示，灵菌红素对BmNPV极早期基因ie-1、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录均有强烈的抑制作用。BmNPV感染72 h后，对照组病毒 ie-1表达量约为灵菌红素处理组的55倍；灵菌红素处理组vp39的表达量只有对照组的1.1%；而灵菌红素处理组p10基因的表达量极低，几乎检测不出。⑷弱酸性条件下，BmNPV表达的GP64蛋白可介导感染细胞发生膜融合。试验分别用低pH（pH4.5）和细胞正常生长所需pH（pH6.2）培养基短暂孵育BmNPV感染细胞，结果显示，对照组有合胞体的形成，而灵菌红素处理组中则没有合胞体的形成，表明灵菌红素可有效抑制BmNPV介导的膜融合。

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第一章 文献综述

1.1 杆状病毒的简介

1.2 灵菌红素的简介

1.3 家蚕核型多角体病毒BmNPV的防控研究

第二章 引言

2.1 研究背景与意义

2.2 技术路线

第三章 灵菌红素对BmNPV子代病毒BV产生的抑制作用及对包涵体OB形成的影响

3.1 实验材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 小结与讨论

第四章 灵菌红素对BmNPV基因组DNA复制的抑制作用

4.1 实验材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 小结与讨论

第五章 灵菌红素对BmNPV病毒RNA转录的抑制作用

5.1 实验材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 小结与讨论

第六章 灵菌红素对BmNPV介导的细胞膜融合的抑制作用

6.1 实验材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 小结与讨论

第七章 结论与讨论

7.1 灵菌红素对BmNPV子代病毒BV产生的抑制作用及对OB形成的影响

7.2 灵菌红素对BmNPV病毒基因组DNA复制的影响

7.3灵菌红素对BmNPV病毒RNA转录情况的影响

7.4 灵菌红素对BmNPV介导的细胞膜融合的影响

参考文献

致谢

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