解淀粉芽孢杆菌SWB16脂肪酶基因的克隆、表达及活性检测

摘要

家蚕是一种鳞翅目模式昆虫，也作为经济性昆虫为养蚕业带来了丰厚的收入。但是蚕病的发生严重制约了蚕桑业的发展，特别是家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）感染导致的血液型脓病，是生产中危害最严重的一类病毒病。家蚕在自然进化中发展出物理阻隔、体液免疫和细胞免疫三道防线来抵抗病原体的侵染。家蚕脂肪酶作为家蚕肠道中的抗病毒蛋白，在家蚕对BmNPV体液免疫中发挥作用已最先被日本研究人员证实。国内学者发现野蚕肠道脂肪酶同样具有抗BmNPV活性，并在体外纯化获得了有抗BmNPV活性的野蚕脂肪酶。此外，有研究团队还建立了增量表达 Bmlipase-1的转基因家蚕品系，有效提高了家蚕对 BmNPV的抵抗力。本实验室前期研究发现家蚕分别以桑叶和柘叶饲养时，其抗BmNPV的能力显著不同，其中柘叶饲养会降低家蚕对BmNPV的抵抗力。进一步研究发现，柘叶饲养蚕肠道内的微生态优势菌群组成类型与桑叶饲养蚕差别较大，且优势菌群丰度降低；肠道内脂肪酶产生菌的种类也明显不如桑叶饲养蚕肠道中的脂肪酶产生菌丰富；消化液中的脂肪酶、胰蛋白酶等抗病毒蛋白的活性亦低于桑叶饲养蚕。上述研究暗示，家蚕肠道菌产生的脂肪酶也可能参与了家蚕对BmNPV的免疫活动，甚至外源微生物所产脂肪酶也可能有此功效。为获得大量高纯度微生物源脂肪酶，本实验选择产脂肪酶的药用植物内生菌解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens SWB16为研究对象，克隆、原核表达其脂肪酶，采用Ni-NTA法进行纯化，并检测其活性及含量，为后续研究奠定了基础。
　　本研究主要内容包括：⑴以SWB16 DNA为模板，利用引物LIP-F和LIP-R进行PCR扩增，成功克隆出SWB16 Lipase基因，其完整ORF长645bp，共编码214个氨基酸。根据预测，该脂肪酶理论分子量为22.73 kDa，等电点为9.82，属于碱性蛋白。SWB16脂肪酶的N端有2个跨膜域，其中第7到第29位氨基酸为第一个跨膜域，第39到第61位氨基酸为第二个跨膜域，但不存在 N糖基化位点。进一步分析其二级结构，发现SWB16脂肪酶具有大量无规则卷曲和延伸片段及少量的α螺旋、β折叠结构，其中第33-134个氨基酸之间为该蛋白的功能结构域。通过NCBI数据库比对分析该脂肪酶的功能结构域，发现第36-180位氨基酸属于脂肪酶家族 Lipase-2，并且在39-138个氨基酸之间存在α/β水解酶家族的保守序列，说明SWB16脂肪酶蛋白属于α/β水解酶家族，具有脂肪酶的特有结构和功能。⑵采用pET28a表达载体进行Lipase基因的亚克隆，成功构建pET28-lipase重组表达质粒，转化E.coli BL21（DE3）后进行原核诱导表达，最佳诱导条件是20 ℃，100 r/min，0.1mmol/L IPTG诱导培养12h。SDS-PAGE检测发现目的蛋白在37 ℃、28 ℃和20 ℃时均主要以包涵体形式表达，也能够可溶表达。⑶利用Ni-NTA亲和层析分离表达的HIS-LIPASE融合蛋白，经超滤浓缩获得纯化的脂肪酶。通过罗丹明 B平板法检测重组蛋白的活性，结果显示含脂肪酶的滤纸片在紫外光下发出橘黄色荧光，表明纯化的脂肪酶样品具有一定的解脂活性。通过BCA法测重组蛋白的含量，显示样品中脂肪酶的浓度较高，约为1.019mg/mL，可用于后续实验。

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第一章 文献综述

1.1 脂肪酶的研究

1.2 蚕的脂肪酶与家蚕核型多角体病毒

1.3 微生物脂肪酶的应用

第二章 引言

2.1 研究背景及意义

2.2 主要研究内容

2.3 技术路线

第三章 解淀粉芽孢杆菌SWB16脂肪酶基因的克隆与生物信息学分析

3.1 实验材料

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.4 小结与讨论

第四章 解淀粉芽孢杆菌SWB16脂肪酶基因的原核表达

4.1 实验材料

4.2 试验方法

4.3 结果与分析

4.4 小结与讨论

第五章 脂肪酶的纯化及活性检测

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 小结与讨论

第六章 总结

参考文献

附录

发表论文及参研课题

致谢