中华鳖Foxl2基因克隆与表达及温度和外源激素对其表达的影响

摘要

在漫长的生命进化过程，性别的遗传是高度保守的，但在基因型性别决定（Geneotypic sex determination，GSD）较为完善的生物类群演化出环境型性别决定（Environmental sex determination，ESD），它们在生命历程中的关系，对认识生命演化规律具有重要意义。ESD类群的性别决定受温度、激素的影响已被报道，在爬行动物中，温度决定后代性别现象十分普遍，性别相关基因更有可能被外源激素和温度所干扰，而关于中华鳖Foxl2基因此方面具体应答变化还不清楚。
　　中华鳖（Pelodiscus sinensis）是一种被广泛养殖的名特品种，隶属于爬行纲、龟鳖目、鳖科（Trionychidae）、鳖属（Pelodiscus）。中华鳖雄性个体比雌性个体生长速度快近1/3，裙边宽厚，胶质含量高，深受市场欢迎，因此，在生产中孵化出更高比例的雄性个体对中华鳖养殖业具有非常重要的意义，本实验对中华鳖性别决定分子机制的研究可为其打下坚实的理论基础。
　　Foxl2（winged helix/forkhead transcription factor gene2）属翼状螺旋/叉头转录因子家族，已在多种物种获得其基因序列，被认为主要参与与卵巢早期发育、分化以及成体卵巢功能的维持，属于雌性相关基因，而关于中华鳖尚未见到相应的报道。
　　为中华鳖性别决定分子机制的研究提供生物学资料，本实验采用克隆、表达和定量RT-PCR等技术对Foxl2基因的序列特征、不同发育时期时空表达以及温度和外源激素对其不同发育时期表达的影响进行了研究。结果如下：
　　1、Foxl2基因的生物信息学分析
　　通过RT-PCR方法获得 Foxl2基因中间cDNA序列（Gen Bank Accession No.KP734210），中华鳖Foxl2 cDNA的蛋白质编码区为903 bp，开放阅读框编码300个氨基酸，包括 DNA结合域（Fork-head(FH)-domain）；将中华鳖 Foxl2氨基酸序列与其它物种进行同源性比对，结果显示脊椎动物Foxl2 FH结构域高度保守；根据NCBI网站的BLASTP进行氨基酸序列分析，中华鳖与龟鳖类同源性最近，尤其与红耳龟，构建各物种Foxl2氨基酸序列的系统进化树，结果则显示中华鳖与西部锦龟遗传距离最近；本实验发现中华鳖Foxl2基因和其它非哺乳动物一样缺少14个丙氨酸组成的聚丙氨酸区和甘氨酸-脯氨酸重复区。
　　2、中华鳖Foxl2基因克隆和组织表达研究
　　RT-PCR结果显示Foxl2基因在卵巢组织强烈表达，其次在脑、脾脏、眼睛、肾脏、肌肉、肝脏、心脏等组织也有一定程度表达；此外精巢也有微弱表达，且显著低于卵巢中的表达量，性腺的表达呈现明显的性别二态性，表明中华鳖Foxl2基因与雌性性腺发育密切相关。
　　3、E2和MT对中华鳖Foxl2表达的影响
　　为了研究外源激素和Foxl2基因的关系，对中华鳖注射雌二醇（E2）和甲基睾酮（MT），并在6 h、12 h、24 h、48 h、7 d和14 d分别检测雌雄个体 Foxl2的表达水平。结果显示E2上调Foxl2表达；MT对Foxl2的表达没有明显差异.表明Foxl2的表达具有激素依赖性。
　　4、E2、MT和温度对中华鳖胚胎发育阶段Foxl2基因的表达探究
　　本实验研究了中华鳖在26.5℃和32℃条件下Foxl2表达规律。定量RT-PCR结果发现，在12 h以前Foxl2表达最高，随着胚胎发育，其表达显著降低，直至34 d，32℃组表达量明显高于26.5℃表达量，Foxl2在32℃组和26.5℃组表达的变化趋势是一致的，34 d为中华鳖性腺发育的一个重要时间点。Foxl2在胚胎发育早期的表达由母型控制。
　　为研究外源激素在中华鳖性别决定和性腺分化中的影响。本实验通过对孵化24 d的胚胎进行E2和MT处理，结果显示，它们均促进Foxl2基因的表达，同时E2先于MT出现其表达高峰期。

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第1章 文献综述

1.1 中华鳖简介

1.2 脊椎动物性别决定机制研究

1.3 中华鳖TSD机制研究

1.4 爬行动物TSD机制性别决定与性别分化相关基因

1.5 叉头框转录因子2（Foxl2）

1.6 Foxl2在爬行动物中的功能

1.7 激素诱导爬行动物性别分化的研究

第2章引言

2.1 研究目的与意义

2.2 研究内容

2.3研究路线

第3章 中华鳖Foxl2基因的cDNA克隆及组织表达分析

3.1 实验材料与试剂

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5小结

第4章 MT和E2对中华鳖成鳖Foxl2基因的表达影响

4.1 实验材料与试剂

4.2 实验方法

4.3 实验结果及分析

4.4 讨论

4.5 小结

第5章 温度、E2和MT对中华鳖Foxl2基因在胚胎中的表达影响

5.1 实验材料与试剂

5.2 实验方法

5.3 实验结果及分析

5.4 讨论

5.5 小结

结论

参考文献

附录一

附录二

致谢

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