MBF2家族鉴定及其成员MBF2-1参与丝素重链转录调控的研究

摘要

家蚕能成为重要的经济昆虫，主要原因在于其可以分泌蚕丝。蚕丝是由家蚕高度特化的器官-丝腺合成分泌的。根据丝腺各区段的结构形态不同，将丝腺分成前部、中部及后部丝腺。丝的两大组成部分—丝素和丝胶，分别是由后部丝腺及中部丝腺合成。其中，丝素是蚕丝的主要组成部分，它由丝素重链蛋白、丝素轻链蛋白及 P25蛋白组成的多聚体蛋白。丝蛋白的表达不仅具有组织特异性，还具有明显的时期特异性。丝蛋白在幼虫前几个龄期合成少量丝蛋白，主要用于眠期时，将自己固定在蚕座上，以便蜕皮。丝蛋白只有在幼虫最后一龄末期才被大量合成。先前研究表明，丝蛋白的调控主要在转录水平，并且丝蛋白的转录发生在每龄盛食期，在眠期则不再转录。虽然研究学者对丝腺高效的蛋白合成能力和基因表达的调控机制进行了持续的研究，但是目前只有少量的丝蛋白转录因子被鉴定，丝蛋白的高效特异表达的调控机制仍待进一步阐明。
　　多蛋白桥梁因子 MBF2最初在丝腺中被分离并证明作为转录调控因子发挥作用。刘庆信等人研究发现 MBF2在丝腺中大量存在，且在丝腺并呈现周期性表达。我们推测 MBF2在丝腺中发挥着重要功能。基于家蚕基因组数据库这一信息平台，对 MBF2进行了分析并对其在丝素重链基因转录调控中的作用进行了研究，研究结果如下：
　　1.家蚕MBF2家族基因的鉴定、表达分析及功能研究
　　以MBF2氨基酸序列为质询序列，采用BLASTP程序检索家蚕9倍基因组数据库及 NCBI库，获得了9个家族候选基因，并将其分别命名为 MBF2-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9。信息分析结果显示，它们均有 EST数据，且有些基因在染色体上成簇分布。氨基酸序列预测分析结果显示该家族基因编码的氨基酸残基数目范围为109-118个，且在N端均有信号肽，表明该家族基因在合成过程中需跨膜，很可能为分泌型蛋白。序列比对结果显示，家蚕 MBF2成员有较高的同源性，序列一致性高达41％。进化分析结果显示，该家族基因为昆虫特有的一类基因，家蚕 MBF2-1、MBF2-2、MBF2-3及 MBF2-7在进化树中聚成一簇，并且它们与黑脉金斑蝶及樗蚕蛾的MBF2有着较近的进化关系。其他成员与参与免疫反应的病原体响应基因βREPAT聚成一簇，说明该基因家族很可能参与家蚕的免疫反应。
　　组织表达谱分析结果显示该家族基因成员具有明显的组织特异性，MBF2-1在丝腺及马氏管中髙量表达，MBF2-5在中肠中髙量表达， MBF2-2、MBF2-3、MBF2-4、MBF2-6和MBF2-8在血液中髙量表达。而MBF2-7在脂肪体，精卵巢中较高的量的表达。时期表达谱分析结果则显示，该家族基因表达呈现明显的时期特异性，有些在预蛹期及蛹期髙量表达如 MBF2-4、-6、-8和-9；而有些基因在蛹期的表达量较低但在幼虫期髙量表达，如 MBF2-2、MBF2-3、MBF2-5；而MBF2-1与上述基因均不同，在五龄期及预蛹期髙量表达；MBF2-7则各时期均有表达，但在眠期的表达量较低。幼虫期是家蚕摄取食物获得能量的时期，而蛹期则是完成成虫组织器官的发生、形成、以及生殖细胞的发育、成熟的时期。丝腺、中肠、血液和脂肪体等组织均是是家蚕物质和能量代谢的主要组织，表达谱分析显示 MBF2家族成员在这些组织及时期髙量表达，说明这些基因在家蚕代谢及发育过程中发挥着重要作用。
　　Bb攻毒实验结果显示，MBF2-4、MBF2-7、MBF2-9在注射 Bb后1h被明显的上调表达，然后在注射3h后下调；MBF2-8则在注射12h后才被上调表达然后恢复到正常水平；与上述基因相反，MBF2-2和 MBF2-3在注射 Bb后3h被明显的下调了，紧接着恢复到正常的表达水平。结果表明这些基因参与家蚕对Bb的免疫反应。饥饿及恢复食桑实验结果显示，MBF2-1、-4及-8在饥饿的条件下被下调表达，而当恢复食桑后，基因开始上调表达；而 MBF-2、-3、-6及-7则呈现出相反表达模式， MBF2-5及 MBF2-9的表达模式上来看，它们的表达同样被影响，但是与其他基因相比，变化的比较迟缓。以上结果表明该家族基因与营养代谢有着很紧密的关联。
　　2. MBF2的原核表达及表达模式分析
　　通过构建原核表达载体并诱导表达纯化MBF2蛋白，并制备了多克隆抗体并用于后续实验。丝腺不同区段qPCR结果显示， MBF2仅在后部丝腺发生转录。丝腺不同区段Western blot结果显示，不仅在后部丝腺检测到了MBF2蛋白的存在，在前部丝腺及中部丝腺也检测了MBF2蛋白的存在。蚕丝免疫荧光结果显示，MBF2蛋白定位在丝胶层，且茧的最外层含量最高。以上结果表明该蛋白是一个分泌型蛋白,这与前面的预测是一致的。MBF2家族成员MBF2-8已经被证明可以参与家蚕的免疫反应，说明茧中的MBF2很可能发挥抵御外来病原入侵的作用，这对以后研究MBF2在免疫方面的功能奠定了基础。
　　对MBF2在后部丝腺的表达时期进行Western blot及qPCR分析，结果显示MBF2仅在后部丝腺发生转录，在四龄眠期髙量表达，在五龄前期也有较髙量的表达，而在五龄后期及上蔟其基本不表达。MBF2呈现出与fibH相反的表达模式，暗示MBF2可能参与丝素重链基因的转录。
　　3. MBF2基因参与fibH的转录调控
　　为了检测MBF2是否参与fibH的调控，我们采用了双萤光素酶报告系统，首先，构建了MBF2细胞过表达载体及fibH的萤火虫萤光素酶报告载体，将它们转入BmE细胞，并进行了酶活测定。结果显示，过表达MBF2可以影响fibH启动子的活性。然而对MBF2的氨基酸序列分析，没有预测到可以与DNA结合的功能域。那么MBF2很可能通过与其他的转录因子相互作用调控fibH的转录。通过亚细胞定位，我们发现MBF2与Bmdimm共定位于细胞核。为进一步确定它们之间的关系，通过利用体外原核表达重组蛋白进行Far-western实验，结果显示，MBF2在体外可以与Bmdimm相互作用。此外，在家蚕BmE细胞系中进行BiFC实验，结果显示，MBF2与Bmdimm可以相互作用。以上结果表明MBF2可以与Bmdimm相互作用。有意思的是，Bmdimm已经证明参与丝素重链调控且对丝素重链起到正调控的作用，但是，当我们同时过表达MBF2和Bmdimm时，fibH启动子的活性下调。结果表明MBF2可以抑制Bmdimm对fibH的调控作用并下调fibH启动子的活性。
　　4. FTZ-F1参与fibH转录调控
　　已经有文献报道 MBF2可以参与 FTZ-F1对下游基因的转录调控，但是两者之间是否存在直接的相互作用关系尚未得知。我们首先原核表达，纯化FTZ-F1蛋白并制备抗体。qPCR及Western blot分析结果显示，FTZ-F1在五龄三天的各组织中均有表达。其中，五龄三天各组织Western blot结果显示FTZ-F1在丝腺、马氏管中的表达量较高。时期表达谱分析结果显示，FTZ-F1在眠期的后部丝腺表达量最高，五龄期以后表达量逐渐降低，在五龄末期及上蔟期基本不表达，这种表达模式与 MBF2表达模式一致，而与 fibH表达模式相反。亚细胞定位、Co-IP、BiFC及 Far-western等实验结果显示 FTZ-F1与MBF2可以相互作用。我们已经证明了MBF2可以参与fibH的转录调控。那么FTZ-F1是否也参与fibH的转录调控呢？
　　我们对 fibH启动子进行了分析，分析结果显示，在 fibH启动子的-389~-397及-652~-659处存在FTZ-F1潜在的结合位点。EMSA及ChIP实验结果显示FTZ-F1可以与 fibH（-389~-397）位点结合。当我们将启动子该位点突变或是截短时，fibH启动子的活性上调。为了对这一点进行进一步检测，将该位点突变后的fibH启动子萤光素酶报告载体与 FTZ-F1过表达载体共转进行酶活检测，结果显示，对 fibH启动子活性没有显著性变化。以上实验结果显示家蚕FTZ-F1通过结合该位点调控fibH启动子活性。
　　我们已经证明单独过表达MBF2或FTZ-F1均可以下调fibH的启动子的活性，并且它们存在相互作用。为了研究两者是否可以一起作用调控fibH，我们将MBF2及FTZ-F1同时过表达，结果显示，fibH启动子的活性下调更加显著。结果说明MBF2与FTZ-F1相互作用并参与fibH的转录调控作用。qPCR分析FTZ-F1及MBF2在大造及高丝量的品种872中后部丝腺的表达量，结果显示MBF2及FTZ-F1在872中的表达量远远低于大造中的表达量。
　　有趣的是，对fibH启动子进行分析，发现fibH启动子上FTZ-F1与Bmdimm的结合位点靠的很近，我们已经证明它们均与MBF2相互作用。那么它们之间是否存在相互作用呢？我们对此进行了研究。BiFC及Far-western实验结果显示，FTZ-F1可以与Bmdimm相互作用。双萤光素酶报告系统结果显示，单独过表达Bmdimm时， fibH启动子活性上调。当将FTZ-F1与Bmdimm共表达时， fibH启动子的活性无明显变化。结果表明BmFTZ-F1可以抑制Bmdimm对fibH启动子活性的上调作用。
　　5.蜕皮激素对fibH调控的影响
　　到目前为止，关于蜕皮激素调控家蚕fibH的报道比较少。为了研究蜕皮激素对家蚕fibH转录调控的影响，我们将fibH启动子的萤光素酶报告载体转入细胞，然后用蜕皮激素处理细胞，酶活检测结果显示，20E可以调控fibH启动子活性，并呈现出剂量依赖性的影响。那么20E是怎么实现对fibH调控的呢？
　　已经有文章报道，无论在体内还是在体外，当用20E处理后部丝腺时均可以诱导FTZ-F1的表达。MBF2与FTZ-F1在后部丝腺中有着相似的表达模式。那么MBF2是否受蜕皮激素调控呢？我们对MBF2启动子进行了预测分析，分析结果显示，在MBF2启动子上游有BrC、EcR、E74A等多个核激素受体的作用元件。蜕皮激素的诱导实验结果显示，无论是在体内还是体外，MBF2均被20E上调表达，我们还发现当MBF2被上调表达时，fibH的表达量却下调了。该结果说明20E很可能通过调控MBF2参与fibH的转录调控。我们已经证明MBF2可以与FTZ-F1相互作用并参与fibH的调控。有文献报道20E可以诱导后部丝腺内FTZ-F1的表达。综合以上结果表明蜕皮激素可以通过MBF2及FTZ-F1介导调控fibH的转录。
　　综合上述结果，20E诱导FTZ-F1及MBF2表达，而这两个蛋白可以与Bmdimm相互作用并抑制其对fibH的调控，从而实现fibH低量表达或是不表达。

目录

声明

第1章文献综述

1.1家蚕生长史

1.2家蚕丝腺的结构组成及生理功能

1.3家蚕丝素蛋白的组成

1.4家蚕丝素蛋白基因的转录调控

1.5家蚕基因组精细图

1.6 MBF2的发现及研究进展

1.7昆虫蜕皮激素及其信号转导途径

1.8蜕皮激素对丝蛋白合成的影响

1.9真核生物转录调控的研究方法

第2章引言

2.1研究背景及意义

2.2拟解决的问题和研究内容

2.3研究思路与技术路线

第3章MBF2家族基因的鉴定、表达分析及功能研究

3.1材料与试剂

3.2方法与步骤

3.3结果与分析

3.4讨论

第4章MBF2-1的原核表达及表达模式分析

4.1材料与试剂

4.2实验方法

4.3结果与分析

4.4讨论

第5章MBF2基因参与fibH的转录调控

5.1材料与试剂

5.2方法

5.3结果与分析

5.4讨论

第6章MBF2可以与FTZ-F1作用参与fibH转录调控

6.1材料与试剂

6.2方法

6.3结果与分析

6.4讨论

第7章蜕皮激素对fibH调控的影响

7.1材料与试剂

7.2方法

7.3结果与分析

7.4讨论

第8章总结与结论

8.1论文总结

8.2工作中待解决的问题

8.3前景与展望

论文创新点

参考文献

缩略词表

已发表及待发表的论文

致谢