基于DArT芯片及叶绿体基因组分析的柑橘属植物进化与分类研究

摘要

柑橘属植物是世界上最重要的果树之一，我国是柑橘属植物重要的发源地。自1753年林奈创立柑橘属以来的260余年时间里，国内外学者们对柑橘属植物的分类问题展开了一系列的研究。然而，由于柑橘属植物芽变率高，种间、属间易于杂交，加之人工栽培历史悠久,栽培范围广从而导致了柑橘属植物的进化分类及重要栽培种、野生种的起源问题存在一定争议，柑橘属植物系统进化的框架仍然有待完善。
　　迄今为止虽然有从形态学到分子学等方面的研究，但柑橘属植物种间关系仍然缺乏充分的分子证据。随着生物信息学及高通量测序技术的发展，新的生物分子标记技术已经逐步应用于植物分类与进化问题的研究中。DArT芯片显示技术（Diversity Arrays Technology,DArT）是在基因组水平上对物种或个体进行鉴别的一种高通量技术。它把基因组文库和基因芯片杂交检测相结合，无需传统的凝胶电泳分析，从而使检测精度和检测通量得到了大大的提高;同时也无需预先知道基因组的序列信息，因而将会是评价柑橘核基因组整体情况的理想技术。
　　本研究利用基因芯片对柑橘属植物进行了研究，并对部分重要柑橘属植物种类进行了高通量测序比对分析。构建DArT芯片评估了24种柑橘及其近缘属植物的进化关系进行。植物叶绿体基因分子量小、组结构简单、单亲遗传，故为分析母系遗传关系的理想手段。因此本研究还选择了6种柑橘及其近缘属植物进行叶绿体全基因组测序，并通过比较分析筛选出了可作为DNA条形码（DNA barcode）的多态性片段。
　　本研究以Swingle系统中的15个柑橘种为芯片探针来源，构建适用于柑橘属植物的DArT芯片，并对24种柑橘及其近缘属植物进化关系进行分析。根据进化分析结果发现，所有柑橘属植物的材料均聚为一支,这表明柑橘属植物可能为单系类群。DArT芯片数据分析结果不支持Swingle分类系统中将柑橘属划分为柑橘属和大翼橙亚属，暗示柑橘属植物可能有一个更加复杂的进化过程。DArT芯片数据分析还发现宜昌橙和莽山野橘可能是两个单独发生的关键种。同时对6种柑橘及其近缘种叶绿体基因进行了高通量测序，其中4种属于柑橘属，另有金柑属和枳属各1种。结合已完成测序的甜橙和来檬叶绿体基因组，比对分析共8个叶绿体基因组之间的差异。其中，叶绿体基因序列最小的是来檬，之后依次为枸橼、柚、甜橙、莽山野橘、金柑、枳以及红河大翼橙。8个柑橘及近缘种叶绿体基因组的基因顺序、所编码的基因数量、内含子以及基因间隔区都高度相似。除来檬编码137个基因之外，红河大翼橙、莽山野橘、道县野橘、枸橼、柚子、甜橙、金柑、以及枳叶绿体基因组都编码一套136个基因，包括102个蛋白编码基因，30个tRNA编码基因，以及4个 rRNA编码基因。进一步分析基因间隔区变异幅度，筛选出潜在的60个可作为分子条形码的区域，为柑橘杂交种的亲本鉴定及分析提供技术支持。
　　本研究结合DNA芯片技术和DNA条形码的思想，在基于形态学特征的基础上对柑橘属植物现有种进行基因组层面的研究，为柑橘属植物分类系统的进一步完善、种的划分及种间关系提供新的证据；并为我国柑橘属植物资源的保护利用和分子鉴定奠定理论及技术基础。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 柑橘属植物的起源与栽培历史

1.2 柑橘属植物的分类与进化研究现状

1.3 柑橘属植物分类与进化研究方法

1.4 基因芯片在植物研究中的应用

第2章 引言

2.1 研究目的及意义

2.2 研究的主要内容

2.3 研究的技术路线

第3章 材料方法

3.1 构建DArT基因芯片的植物材料与方法

3.2 叶绿体基因组分析的材料与方法

第4章 结果分析

4.1 DArT 芯片构建与评估

4.2 基于DArT芯片的柑橘及其近缘种进化研究

4.3 基于叶绿体基因组的进化分析

第5章 讨论

5.1 柑橘属植物的原生种类及数目

5.2 原生种类间的进化关系

5.3 筛选柑橘属条形码

第6章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

附录

致谢

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