养殖大鲵肠道菌群结构及肠道细菌药敏性研究

摘要

中国大鲵是我国二级珍贵保护动物，同时也是我国重要的特种经济动物之一，大鲵是鱼类和爬行类的过渡物种，有着独特的生物学特性、生活环境和进化地位。研究表明，肠道菌群和动物机体的生长发育、营养吸收、物质代谢、疾病发生和免疫调控等有着非常密切的关系，大鲵在独特的生活环境下或许有着独特的菌群结构，但是，目前有关大鲵肠道菌群的研究报道仍十分缺乏。本实验采用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、高通量测序技术和传统培养法研究了重庆市武隆区火炉镇大鲵养殖场大鲵的肠道菌群结构，同时使用30种抗生素对分离出的大鲵肠道细菌进行药敏特性研究，以期进一步揭示大鲵肠道菌群与健康的关系，为大鲵的疾病防控提供一定的实验依据。研究结果如下：
　　1．大鲵肠道菌群的变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）分析
　　采用PCR-DGGE技术，研究大鲵肠道菌群结构，得到了大鲵肠道内优势菌群的基因指纹图谱。结果显示，不同健康大鲵的肠道菌群结构组成相似度达到42%，肠道内细菌种类丰富，香农维纳多样性指数较高，肠道细菌均匀度十分接近，无较大差异。对全部56个条带进行切胶回收，成功测序的条带有39个，肠道核心菌群为变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门4个门类，最亮的条带主要是Aquabacterium属、Lacinutrix属、Actinopolyspora属、节杆菌属、沙雷氏菌属和梭菌属。
　　2．大鲵肠道菌群的高通量测序分析
　　为了进一步了解大鲵肠道菌群的全貌，采用高通量测序技术，对大鲵肠道菌群结构进行了详细的研究。结果显示，养殖大鲵肠道内的细菌种类丰富，核心菌群包括拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门和疣微菌门，而且拟杆菌门的数量最多，大鲵的肠道优势菌为拟杆菌属的细菌。经过饥饿处理之后，核心菌群种类基本没有变化，但是变形菌门和梭杆菌门的数量有一定的下降，而厚壁菌门的数量有较明显的上升趋势。对肠道细菌样本进行α多样性分析，发现饥饿处理后肠道细菌的多样性、丰富度、均匀度都有一定程度的下降。进行β多样性分析发现，在摄食组和饥饿组组内，肠道细菌的物种多样性差异很小，摄食组与饥饿组肠道细菌的物种多样性差异较大。摄食组组内物种组成结构非常相似，但是，摄食组和饥饿组进行比较时，发现两组间物种组成差异非常明显。
　　3．传统培养法分离鉴定大鲵肠道细菌
　　采用传统培养法，利用LB、TSA、EE、BHI4种培养基对健康大鲵肠道细菌进行分离纯化，并对分离菌株进行16S和生理生化鉴定。结果显示，本试验共分离得到9株细菌，包括7株变形菌门细菌和2株厚壁菌门细菌。健康大鲵肠道正常细菌包括益生菌、条件致病菌和致病菌，其中，益生菌是巴达维亚芽孢杆菌，条件致病菌包括嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、鲶鱼爱德华氏菌、产气肠杆菌、塔氏弧菌、奇异变形杆菌和纯黄肠球菌，致病菌是类志贺邻单胞菌。
　　4．大鲵肠道分离细菌药敏性分析
　　采用30种抗生素研究了9株肠道细菌的药敏特性。结果显示，9株肠道细菌对多数抗生素有较强的敏感性，使用抗生素对肠道细菌有较大的影响。头孢他啶、氧氟沙星、多西环素、哌拉西林和头孢曲松能抑制多种条件致病菌和致病菌，同时对有益细菌影响较小，可以有效改善大鲵肠道菌群结构。
　　综上所述，本文结论如下：
　　本研究采用的三种不同方法研究了大鲵肠道菌群结构，传统培养法局限性较大，无法全面揭示肠道菌群结构，PCR-DGGE只能测出肠道优势菌的序列，微量细菌的序列无法得到，三种方法中以高通量测序技术的测序量足够且可信，不仅能得到优势菌的序列，还能得到微量细菌的序列，能较为准确和全面地反映健康大鲵肠道菌群结构。养殖大鲵肠道核心菌群主要是拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门以及疣微菌门的细菌组成，其中，拟杆菌属的细菌是肠道内的优势菌。
　　药敏特性研究显示，30种抗生素对每种大鲵肠道细菌有不同程度的影响，应合理使用抗生素治疗大鲵疾病，尽量选用对条件致病菌和对致病菌敏感而益生菌不敏感的抗生素。

目录

声明

第1章 文章综述

1.1 大鲵的分类地位与生物学特性

1.2 大鲵的种群现状和养殖模式

1.3 大鲵常见疾病的研究概况

1.4 动物疾病与肠道菌群的关系

1.5 动物肠道菌群的研究现状

1.6 动物肠道菌群的研究方法

1.7 研究目的及意义

第2章 引言

第3章 大鲵肠道菌群结构的PCR-DGGE分析

3.1 材料与试剂

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 结论

第4章 大鲵肠道菌群结构的高通量测序分析

4.1 材料和试剂

4.2 实验方法

4.3 结果

5.4 讨论

5.5 结论

第5章 大鲵肠道细菌的分离鉴定

5.1 材料与试剂

5.2 实验方法

5.3 结果

5.4 讨论

5.5 结论

第6章 大鲵肠道细菌药敏性研究

6.1 材料与试剂

6.2 实验方法

6.3 结果

6.4 讨论

6.5 结论

参考文献

致谢