羟基红花黄色素A对LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤的干预作用及分子机制研究

摘要

奶牛子宫内膜炎是引起奶牛发生不孕症的最主要原因之一，可引起增加人工授精配种次数，延长奶牛的受孕间隔，降低奶牛妊娠率和受孕率等重大问题，往往给养殖户带来很大的经济损失。病原菌感染是引起奶牛子宫内膜炎的主要原因之一其中以大肠杆菌为主，大肠杆菌进入机体后可释放产生大量 LPS，引起奶牛子宫发生严重炎症反应，引发子宫内膜炎。常用的中药红花，常用于奶牛子宫内膜炎治疗，具有活血通经、祛瘀止痛的作用，而羟基红花黄色素A（HYSA）是中药红花的最主要水溶性有效成分之一。因此，本研究为了探讨HSYA对LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤的干预作用及其分子机制，开展了以下研究：
　　1.通过胶原蛋白酶和胰蛋白酶消化法分离、培养奶牛子宫内膜上皮细胞，再采用差速消化法纯化得到上皮细胞，免疫组化法鉴定了奶牛子宫内膜上皮细胞。成功建立了奶牛子宫内膜上皮细胞的分离培养方法，为后续研究奠定了研究基础。
　　2.通过MTT法检测不同浓度LPS对奶牛子宫内膜上皮细胞体外增殖的影响，结果表明：1μg/mL LPS作用24h时促进细胞增殖作用最为明显（P＜0.05），ELISA检测结果表明，1μg/mL LPS可诱导奶牛子宫内膜上皮细胞IL-1β和TNF-α分泌量显著升高（P＜0.05），确定LPS的作用浓度为1μg/mL，作用时间是24h。
　　3.以1μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL的HSYA作用24h后，MTT法检测HSYA对奶牛子宫上皮细胞增殖的影响。结果表明：HSYA对奶牛子宫内膜上皮细胞增殖无明显毒性，且促进其增殖。因此，确定HSYA作用浓度分别为80μg/mL（高剂量组）、20μg/mL（中剂量组）、5μg/mL（低剂量组）。
　　4.分别用高、中、低剂量的HSYA作用奶牛子宫内膜上皮细胞24hr后，采用real-time PCR法检测上皮细胞中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αmRNA表达量。结果表明，LPS组奶牛子宫内膜上皮细胞TLR4和细胞因子IL-1β、1L-6、IL-8、TNF-α、mRNA表达量显著高于对照组（P＜0.05），经5、20、80μg/mL的HSYA作用奶牛子宫内上皮细胞24hr后，各组细胞TLR4和细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8和1L-6 mRNA表达量均显著降低（P＜0.05），说明HSYA可通过抑制LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞TLR4和相关炎性细胞因子mRNA表达起抗炎作用。
　　5.通过Western-blot检测奶牛子宫内膜上皮细胞中NF-κB、MAPKs信号通路关键蛋白 p-IκBα/IκBα、p-p65/p65蛋白以及 P-JNK、p-pP38、p-ERK1/ERK2的表达变化，确定HYSA对LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤的细胞信号通路的作用，确定其分子调控机制。结果表明：LPS可刺激奶牛子宫内膜上皮细胞的p-IκB/IκB和p-p65/p65相对比率均显著升高（P＜0.05），同时还刺激p-JNK、p-ERK1/2、p-p38蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），即LPS可通过诱导NF-?B和MAPK信号通路的激活，诱导奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤；而经过高、中、低剂量的HSYA作用后，奶牛子宫内膜上皮细胞的p-IκB/IκB和p-p65/p65相对比率显著降低（P＜0.05），与LPS组相比，除低剂量HSYA组上皮细胞的p38磷酸化水差异不显著（P＞0.05）外，中、高剂量的HSYA处理后细胞的JNK、ERK1/2、P38磷酸化水平均显著降低（P＜0.05）。
　　因此，HSYA可通过抑制NF-?B和MAPK信号通路的激活，抑制下游炎性细胞因子表达，从而达到抗炎作用。

目录

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英文缩写

第一章 文献综述

1.奶牛子宫内膜炎的概述

2. LPS诱导炎症模型的研究

3 羟基红花黄色素A的研究进展

4 研究目的与意义

第二章 引言

第三章 奶牛子宫内膜上皮细胞的分离、培养及鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与分析

4 结论

第四章 LPS诱导奶牛子宫内膜细胞上皮细胞炎性损伤模型构建研究

1 材料和方法

2 结果

3 分析与讨论

4小结

第五章 HSYA对LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞炎性细胞因子mRNA表达的影响

1材料和方法

2 结果

3分析与讨论

4 小结

第六章 HSYA对LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB和MAPKs信号通路的影响

1 材料与方法

2 结果

3 分析与讨论

4.小结

第七章 结论

参考文献

致谢

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