青蒿茉莉酸受体AaCOI1的功能研究

摘要

青蒿素（Artemisinin）是一种经典的C15类型的倍半萜类化合物，因其结构中特有过氧桥键结构，使得其对脑型疟疾和抗氯喹疟疾的治疗十分明显；世界卫生组织（WHO）推荐青蒿素联合疗法作为治疗疟疾的首选。最新的研究发现青蒿素对于抵抗病毒，抗肿瘤活性，治疗糖尿病和肺结核等疾病的治疗也有显著效果，其市场需求巨大。然而青蒿素的化学全合成因其合成产率低，副产物多，而且毒性较大，短时间内还很难应用于实际的生产。利用发酵工程部分合成青蒿的前体，然后再经过体外氧化合成青蒿素的技术虽然已经比较的成熟，但是其产量有限，相对于巨大的市场需求，任然存在巨大的市场差额。目前，从青蒿中分离提取青蒿素仍然是青蒿素市场供应的主要来源，但是野生型青蒿中提取青蒿素的含量极低，约占植株全部干重的0.01％-0.8%，于是，如何提高青蒿植株中青蒿素的累积，就成了当今研究植物次生代谢产物的主要目标。
　　茉莉酸酯类是茉莉酸（Jasmonic acid，JA）及茉莉酸衍生物的统称，是重要的植物信号分子。对于植物来说，其生长发育的过程、对环境改变的防御响应和它的次级代谢产物的合成和积累都与茉莉酸有着举足轻重的作用。已有研究发现外源喷洒茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）处理青蒿植株时可以使青蒿素的含量显著累积上调。COI1作为茉莉酸途径的唯一受体，主要和SCF形成SCF COI1复合物存在于植物体内，对植物的生长、耐盐性和抗逆性都起到了至关重要的作用。在番茄、水稻和橡胶等植物中对JA信号通路中的COI1受体相关功能已有一定的研究，而在青蒿中JA信号通路对青蒿素的生物合成调控具有重要作用，但对于JA信号通路中的基本原件并不是很清楚，因此本研究从青蒿中克隆JA信号通路受体编码基因AaCOI1并验证其生物学功能，为揭示JA调控青蒿素生物合成的分子机制奠定重要基础。
　　本文以NCBI登录的拟南芥AtCOI1序列为基准，通过blast比对在青蒿转录组中查找到对应的COI1基因序列。通过PCR克隆后测序并对序列分析发现：AaCOI1的cDNA全长1767 bp（GenBank登录号：KY706201），它包含1752 bp的开放阅读框(Coding Domain Sequence, CDS)，并编码一个584个氨基酸的蛋白质。蛋白质属于亲水性蛋白，其富含亮氨酸重复序列（LRR）和F-box结构域，但没有跨膜区、复合螺旋区、信号肽等结构域。亚细胞定位结果显示：AaCOI1特异性定位在细胞核中，双分子荧光互补（BiFC）技术实验结果显示，AaCOI1与青蒿中的AaJAZ1和AaJAZ5存在相互作用。从青蒿cDNA文库中克隆得到AaJAZ5序列，cDNA全长为1044 bp（GenBank登录号：KX034796），包括564 bp的CDS，且编码188个氨基酸。基因表达谱结果显示；AaCOI1、AaJAZ5在青蒿的根中的相对表达量较高，在叶、花和茎中表达量较低；同时发现，AaCOI1、AaJAZ5受到MeJA诱导性表达。MeJA处理后AaCOI1、AaJAZ5基因的表达量在3h时呈显著提高（P＜0.05），这些结果进一步证实了AaCOI1和AaJAZ5都是JA信号通路的组成元件。在拟南芥中过量表达AaCOI1基因，因纯合突变的coi1-1是雄性不育，而coi1-1杂合型拟南芥是可育的，所以转入杂合型coi1-1的拟南芥中，筛选并获得纯系的纯合突变背景的转基因拟南芥可发育成角果，并且在MeJA处理拟南芥后发现互补之后的拟南芥对甲基茉莉酸敏感，与纯合突变的coi1-1相比根会变短和野生型拟南芥情况一样，回复突变后的拟南芥在MeJA处理后花青素的含量以及花青素合成途径上相关基因表达量都在增加，这些结果都说明了AaCOI1可以互补于纯合突变的拟南芥，进一步验证了，在甲基茉莉酸途径中AaCOI1的重要作用。综上所述，本研究克隆了来源于青蒿编码JA信号受体蛋白的COI1基因，采用qPCR研究了其在不同组织及诱导条件下的表达差异；通过亚细胞定位分析AaCOI1定位于细胞核中表达，并且能够与JAZ5在核中出现物理结合，说明本研究克隆的AaCOI1参与了JA信号通路；为进一步研究AaCOI1的生物学功能，采用突变体表型恢复的方法在coi1-1拟南芥中过表达AaCOI1，结果发现能够恢复拟南芥对茉莉酸反应，即恢复育性，在MeJA诱导下根生长出现抑制、花青素含量提高以及花青素合成途径相关基因表达量提高等表型。这些证据比较充分的证实了AaCOI1的生物学功能是作为青蒿JA信号通路的受体。

目录

声明

第1章文献综述

1.1研究背景

1.2 青蒿

1.3青蒿素

1.4影响青蒿素含量因素

1.5 MeJA对植物作用机理与受体蛋白COI1

第2章绪论

2.1 研究目的和意义

2.2 研究内容和范围

2.3 研究的技术路线

第3章材料与方法

3.1实验材料及试剂耗材

3.2 常规方法与步骤

3.3 基因克隆及生物信息学分析

3.4 AaCOI1和AaJAZ5的组织表达及诱导分析

3.5 亚细胞定位

3.6双分子荧光互补

3.7 AaCOI1在拟南芥coi1-1突变体植株中功能互补实验

第4章结果与讨论

4.1 青蒿AaCOI1基因克隆与分析

4.2 青蒿AaJAZ5基因克隆与分析

4.3 AaCOI1和AaJAZ5的组织表达分析

4.5 AaCOI1和AaJAZ5的诱导表达分析

4.6 AaCOI1的亚细胞定位

4.7 AaCOI1与AaJAZ的相互作用

4.8 AaCOI1基因的功能验证

4.9 AaCOI1转基因拟南芥在MeJA处理后根长和花青素的测定

4.10MeJA处理后AaCOI1转基因拟南芥后花青素合成途径相关基因表达量变化

第5章结论与展望

5.1 结论与分析

5.2 展望

参考文献

附录

附录1：常用抗生素以及细菌培养基的配置

附录2：MS培养基配方

附录3：缩略词表

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢