铜绿微囊藻溶藻菌的分离鉴定、溶藻特性及溶藻机制研究

摘要

随着现代社会的快速发展，全球范围内水生态系统藻类水华尤其是有害蓝藻水华(Harmful cyanobacterial algal blooms, CyanoHABs)的爆发频率和影响程度逐年递增。微生物控藻技术因为具有成本低、操作简单和环境友好等特点而备受关注。本文以分布广泛、危害最大的水华蓝藻铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）为控制对象，从重庆紫色土中分离出一批具有高效溶藻活性的溶藻菌，以溶藻效果最好的放线菌G3、G9和细菌AF-1为研究对象，对藻-菌相互作用关系、溶藻特性和溶藻机制进行了深入研究，主要结果如下所述：
　　1.溶藻放线菌的分离与鉴定。本部分研究从紫色土中分离得到了10株高效溶藻放线菌，其中放线菌G3和G9的溶藻效果最好（溶藻效率分别为84％、87%， t=5 d），结合它们的形态学特征以及16S rRNA基因序列分析，G3和G9被鉴定为链霉菌属(Streptomyces)。
　　2. Streptomyces sp. G3和G9溶藻特性的研究。G3和G9溶藻具有广谱性，不仅对铜绿微囊藻表现出高效的溶藻效果，对其它常见水华蓝藻，如水华鱼腥藻、颤藻和席藻等也具有很好的溶藻效果，溶藻效率均达到了60%以上（t=5 d），并且能够造成丝状蓝藻藻丝的断裂。这两株菌的溶藻效率随铜绿微囊藻的浓度增加而降低，控制对数生长期藻的效果好于稳定期的藻，但随着培养时间的延长最终都能导致藻的黄化死亡。透析袋培养实验结果表明，G3和 G9是通过释放某种溶藻活性物质间接溶藻。
　　3.多功能溶藻菌的分离鉴定及其溶藻特性的研究。利用平板对峙法从土壤中分离了一株具有禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）强拮抗活性的细菌，命名为AF-1。该菌在平板上抑制禾谷镰刀菌生长，形成明显的抑菌圈，并且导致真菌菌丝发生明显的形态变化。根据菌体细胞和菌落形态学特征及16S rRNA基因序列分析将 AF-1鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus）细菌。AF-1对铜绿微囊藻有强烈的杀灭作用，5 d的溶藻效率可达93%。AF-1的有效溶藻细胞密度低至1.56×103 cfu/mL。此外，该菌株还能利用铜绿微囊藻释放的营养物质进行生长发挥溶藻活性。AF-1的溶藻效率与铜绿微囊藻的生长时期有关，几乎不受自身生长时期的影响；AF-1对铜绿微囊藻的溶藻作用具有种属特异性，对丝状蓝藻和真核绿藻的生长没有抑制作用。
　　4. Bacillus sp. AF-1溶藻活性物质及溶藻机制的研究。AF-1的溶藻方式为分泌活性物质间接溶藻。分泌的溶藻活性物质具有耐热、耐酸碱和蛋白酶的特点，表明活性物质不是蛋白质，是性质稳定的化合物；采用不同极性的有机物抽提溶藻活性物质，发现AF-1分泌的溶藻活性物质亲水性更强。对溶藻过程中藻细胞的形态变化和ROS积累水平研究结果表明，在AF-1的培养液上清作用下，铜绿微囊藻细胞内积累高水平的 ROS，进而造成藻细胞的氧化胁迫，导致藻细胞完整性受到严重破坏，最终导致藻细胞的裂解死亡。用 RT-qPCR研究藻细胞重要基因差异表达的结果表明，AF-1无菌滤液造成藻细胞的DNA损伤，影响藻细胞的正常分裂，同时严重影响铜绿微囊藻的光合系统及抑制微囊藻毒素的合成。

目录

声明

第一章 绪论

1 有害蓝藻水华

1.1 以微囊藻为主的有害蓝藻水华爆发现状

1.2 有害蓝藻水华的成因

1.3 有害蓝藻水华的危害

2 有害蓝藻水华控制技术

2.1 物理除藻

2.2 化学除藻

2.3 生物除藻

3 溶藻菌及其研究进展

3.1 溶藻菌种类

3.2 溶藻作用机制

4 研究目的及内容

4.1 研究意义与研究目的

4.2 主要研究内容

4.3 技术路线

第二章 实验材料与方法

1 实验材料

1.1 土壤样品和供试藻株

1.2 实验用培养基

1.3 实验试剂

1.4 主要仪器

2 实验方法

2.1 溶藻菌的分离筛选及鉴定

2.2 溶藻放线菌的溶藻特性试验

2.3 溶藻细菌AF-1的溶藻特性试验

2.4 溶藻细菌AF-1溶藻活性物质性质研究

2.5 藻细胞扫描电镜观察

2.6 藻细胞内活性氧的测定

2.7 实时定量PCR

第三章 研究结果与分析

1 溶藻放线菌的分离鉴定及溶藻特性研究

1.1 溶藻放线菌的筛选及鉴定

1.2 溶藻放线菌的溶藻特性

1.3 小结

2 溶藻细菌AF-1的分离鉴定

2.1菌株AF-1的真菌拮抗作用

2.2菌株AF-1的菌种鉴定

2.3菌株AF-1的溶藻作用

2.4小结

3 溶藻细菌AF-1的溶藻特性

3.1 溶藻细菌AF-1的细胞密度阈值

3.2 不同生长时期溶藻细菌AF-1对不同生长时期微囊藻的溶藻效果

3.3 溶藻细菌AF-1的溶藻特异性

3.4 溶藻细菌AF-1的溶藻方式

3.5 溶藻细菌AF-1活性物质性质研究

3.6小结

4 溶藻细菌AF-1的溶藻作用机制研究

4.1 藻细胞的形态变化

4.2 藻细胞内活性氧水平的变化

4.3 藻细胞重要基因的表达

4.4 小结

第四章 结论与展望

1 结论

2 展望

参考文献

致谢

在学期间所发表的论文