Clostridium perfringens enterotoxin(CPE)肽段通过作用Claudin5蛋白调控血脑屏障通透性的研究

摘要

目的： 探讨cCPEY306W/S313H通过作用Claudin5蛋白对血脑屏障通透性的影响，寻找可瞬时调控血脑屏障通透性的生物活性大分子。 方法： 本研究通过体外及体内实验证实cCPEY306W/S313H通过作用Claudin5蛋白对血脑屏障的通透性的影响： 体外实验： 1.利用bEnd.3细胞系，构建Blood-Brain Barrier(BBB)体外模型。 2.研究cCPEY306W/S313H与血脑屏障模型中Claudin5蛋白特异性结合情况。 3.通过跨细胞内膜内阻（Transendothelial electrical resistance，TEER)实验，证实cCPEY306W/S313H可调控血脑屏障通透性。 4.利用基因敲除技术构建shclaudin5-bEnd.3细胞系，并以此构建BBB体外模型，进一步验证cCPEY306W/S313H与Claudin5蛋白的特异性结合。 体内实验： 5.以斑马鱼为载体，验证cCPEY306W/S313H与脑血管中Claudin5蛋白特异性结合情况。 6.通过血管造影技术，研究 cCPEY306W/S313H对斑马鱼血脑屏障通透性的影响。 结果： 1.本实验成功通过bEnd.3细胞构建体外血脑屏障模型。 2.本实验利用基因敲除技术，成功构建shclaudin5-bEnd.3细胞系。 3.bEnd.3细胞体外培养至192 h时，TEER值处于稳定期。在TEER稳定期，分别加用cCPEY306W/S313H及GST蛋白，结果表明，加入蛋白后30 min，各组TEER值轻微的上升，加入蛋白后1 h，3 h，18 h，24 h，cCPEY306W/S313H组的TEER值一直处于下降的趋势，相反地，GST组的TEER值与实验对照组的未见明显变化。但洗脱后的24 h，cCPEY306W/S313H，GST及实验对照组的TEER未见明显差异。 4.利用间接免疫荧光技术，鉴定 GST-cCPEY306W/S313H及 GST蛋白与Claudin5蛋白的作用关系。在 cCPEY306W/S313H作用的第1 h，cCPEY306W/S313H与Claudin5蛋白共定位结合；第24 h，Claudin5蛋白逐渐与cCPEY306W/S313H解离；但在洗脱后24 h，Claudin5蛋白重新定位于血脑屏障上。在这过程中，GST蛋白始终未被检测出来。 5.通过显微注射 cCPEY306W/S313H，在激光共聚焦显微镜下观察发现，斑马鱼脑血管内cCPEY306W/S313H与Claudin5蛋白结合并且结合后血脑屏障的通透性有所提高。 结论： 1.本研究证实cCPEY306W/S313H能够与血脑屏障中Claudin5特异性结合。 2.斑马鱼体内实验证明 cCPEY306W/S313H能够与 Claudin5特异结合并使血脑屏障通透性提高。 3. cCPEY306W/S313H与Claudin5的相互作用具有可逆性。

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1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 体外内皮细胞单细胞层模型的建立

3.2 Shclaudin5-bEnd.3细胞株构建及鉴定

3.3 cCPEY306W/S313H特异结合Claudin5蛋白及其对体外内皮细胞单细胞模型渗透性的影响

3.4 cCPEY306W/S313H对shclaudin5-bEnd.3细胞构建的体外内皮细胞单细胞模型渗透性的影响

3.5 cCPEY306W/S313H在斑马鱼体内对血管屏障中Claudin5蛋白的调控作用及对血脑屏障通透性的影响

4 讨论

4.1体外内皮细胞单细胞模型的构建

4.2 Claudin5蛋白在血脑屏障（Blood-brain barrier）中的作用

4.3 Claudin5蛋白与疾病的关系

4.4 CPEY306W/S313H对血脑屏障通透性的影响

5 小结

参考文献

综述:Claudin5 蛋白对血脑屏障通透性调控作用的研究进展

致谢

附录一 缩写词中英文对照表

附录二 在读硕士期间科研情况