针对survivin基因不同区域的RNAi实验研究

摘要

【目的】 根据RNAi技术，设计并合成针对survivin基因的外显子、内含子及外显子连接处的siRNA，转染至人宫颈癌细胞中（Hela），干扰survivn基因表达。从mRNA、hnRNA和蛋白质水平观察不同位点的干扰序列的沉默基因的效果，从转录水平基因沉默(tran-scriptional gene silencing，TGS）和转录后沉默（post-transcriptional Gene Silencing，PTGS）初步探讨不同序列、不同区域的siRNA和RNAi机制。 【方法】 根据siRNA的设计原则，分别设计并合成针对外显子的2组siRNA、针对外显子连接处的2组siRNA及针对内含子的2组siRNA，同时再合成1组作为阴性对照的siRNA，分别转染至Hela细胞中。通过实时荧光定量PCR在mRNA和hnRNA水平检测survivin基因的转录情况，再进一步通过western blot在蛋白质水平检测基因的表达情况，分三个时间段检测蛋白表达的差异。 【结果】 成功设计并合成针对survivin基因的外显子、内含子及外显子连接处的六组siRNA，转染至HeLa细胞中。与空白对照组相比，在RNA的水平上，各组均出现不同程度的抑制效果（P＜0.05）；在蛋白质水平上，24h后有部分组别出现抑制，48h的时候全部呈现抑制状态（P＜0.05），72h时抑制效果出现不同程度的减弱。其中，外显子连接处的抑制效果最为明显，并且持续时间较长。 【结论】 针对基因的mRNA和hnRNA设计的siRNA是可以沉默靶基因的，即RNAi可以作用于基因的编码区和非编码区。其中，外显子连接处的干扰效果优于其他区域，这可能与RNAi的机制TGS、PTGS机制相关。

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1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

2 材料与试剂

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 样本中总RNA鉴定

3.2 实时荧光定量PCR检测mRNA和hnRNA的表达

3.5 总蛋白定量

3.6Western Blot检测细胞总蛋白中Survivin的表达

4 讨论

5.小结

参考文献

综述:肿瘤特异性启动子的研究及其应用

致谢

附录一 缩略词表

附录二 在读硕士期间发表的论文