铜绿假单胞菌PAO1毒素-抗毒素系统的预测及功能验证

摘要

【目的】 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种重要的条件致病菌，是医院内感染最常见的病原菌之一，该菌具有较强的耐药性，其致病机理目前尚不完全明了。有文献报道PA持留现象与疾病复发和病程迁延有关，而细菌毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）系统可介导细菌持留表型形成。本研究应用毒素-抗毒素数据库（Toxin-antitoxin database，TADB）在线工具，分析PA基因组DNA上Ⅱ型TA系统，构建pa0124/pa0125基因双表达载体A-T-pJS298，观察pa0124/pa0125基因选择性表达对大肠埃希菌BL21(DE3)生长的影响，探讨PA基因组上存在的TA系统，为研究TA系统介导PA持留表型形成机理奠定基础。 【方法】 TADB为细菌、古细菌Ⅱ型TA系统在线预测工具，其根据已鉴定的TA系统编码基因保守序列和TA系统典型遗传特征进行预测，如2个基因紧密相连，所编码的蛋白相对分子质量都较小等。通过 TADB在线工具分析铜绿假单胞菌基因组DNA上可能存在的Ⅱ型TA系统，利用国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）网站上所提供的局域相似性比对（basic local alignment search tool，BLAST）对TA系统编码蛋白进行分析，进一步确定毒素蛋白、抗毒素蛋白。 采用双酶切法在 pJS298基础上构建 pa0124/pa0125基因双表达载体A-T-pJS298，测序鉴定后，将重组质粒 A-T-pJS298通过化学转化法导入大肠埃希菌BL21(DE3)中，然后，以含50μg/ml卡那霉素和0.2%葡萄糖的 LB平板筛选获得阳性细菌。分别挑取单菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的的液体LB培养基中，37℃振荡过夜培养。次日按1:50的比例转接于含50μg/ml卡那霉素的的液体LB培养基中，于37℃振荡培养至OD600约为0.4，然后，取4支试管并编号为A、B、C、D，并取4 ml上述OD600约为0.4的菌液分别加入到4支试管，同时加入诱导剂IPTG（终浓度为1 mmol/L）或L-阿拉伯糖（0.2％），即A试管（IPTG-，L-阿拉伯糖-）两种诱导剂都不加，B试管（IPTG-，L-阿拉伯糖+）仅加入L-阿拉伯糖，C试管（IPTG+，L-阿拉伯糖-）仅加入IPTG，和D试管（IPTG+，L-阿拉伯糖+）同时加入IPTG和L-阿拉伯糖。于加入诱导剂后1，2，3，4，5，6，7小时分别吸取菌液测定记录OD600值，绘制大肠埃希菌生长曲线。 【结果】 1.用TADB在线工具分析出14对TA系统，其中4对预测的TA系统的评分>60％，即pa0124/pa0125、pa1030/pa1029、pa1878/pa1879和pa3270/pa3269。 2.PCR法和测序鉴定结果表明本课题在质粒pJS298的基础上成功构建pa0124/pa0125基因双表达载体。 3.在不加 IPTG和L-阿拉伯糖的（IPTG-，L-阿拉伯糖-）管或只加入 IPTG的（IPTG+，L-阿拉伯糖-）管的情况下，细菌能正常生长，生长曲线无明显改变；仅加入L-阿拉伯糖的（IPTG-，L-阿拉伯糖+）管，即加入诱导剂 L-阿拉伯糖诱导毒素蛋白 PA0124表达的细菌在约4 h后生长受到明显抑制，在加入阿拉伯糖4 h后OD600维持在1.5～2.0低值，生长曲线低平；而（IPTG+，L-阿拉伯糖+），即同时加入 IPTG和 L-阿拉伯糖诱导两种蛋白质表达的细菌生长无明显抑制，生长曲线接近正常水平。在加入诱导剂6 h时肉眼观察到（IPTG-，L-阿拉伯糖-）、（IPTG+，L-阿拉伯糖-）和（IPTG+，L-阿拉伯糖+）试管菌液浑浊程度无明显差异，而（IPTG-，L-阿拉伯糖+）试管中菌液的浑浊度较其他试管明显澄清，与生长曲线图相符。 【结论】 1.用 TADB在线工具分析出4对评分大于60%能的 TA系统，即pa0124/pa0125、pa1030/pa1029、pa1878/pa1879和pa3270/pa3269。 2.成功构建了基于质粒pJS298的pa0124/pa0125基因双表达载体A-T-pJS298。 3.铜绿假单胞菌的pa0124/pa0125基因可能是一对具有生物学活性的毒素-抗毒素系统。

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1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 毒素-抗毒素的生物信息学分析

3.2 双启动子表达质粒pJS298的解析

3.3 重组质粒T-pJS298的构建

3.4 重组质粒T-pJS298的鉴定

3.5 重组质粒A-T-pJS298的构建

3.6 重组质粒A-T-pJS298的鉴定

3.7 细菌诱导表达及生长曲线的绘制

4 讨论

5 小结

参考文献

综述:细菌毒素-抗毒素系统介导持留菌形成机制的研究进展

致谢

附录一： 缩写词中英文对照

附录二：测序结果

附录三：在读期间的科研情况