第一个书签之前
摘 要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 猪传染性胃肠炎病毒
1.1.1 猪传染性胃肠炎概述
1.1.2 TGEV的分子生物学
1.2 TGEV S1蛋白
1.2.1 S1蛋白的结构
1.2.2 主要的细胞受体
1.2.3 唾液酸结合特性
1.2.4 入侵宿主细胞
1.3 酵母双杂交系统
1.3.1 基本原理
1.3.2 主要优势
1.3.3 衍生的其他系统
1.3.4 广泛的应用
1.3.5 Clontech公司的Y2H系统
1.4 GST-pull down技术
1.5 荧光定量PCR
1.5 MTT空斑形成实验
1.6 研究目的及意义
第2章 引言
2.1 研究背景
2.2 目的意义
第3章 TGEV S1蛋白诱饵载体构建及诱饵蛋白的检测
3.1 材料
3.1.1 质粒、菌株和细胞
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要实验仪器设备
3.1.4 主要试剂的配制
3.2 方法
3.2.1 TGEV S1诱饵载体构建及鉴定
3.2.2 TGEV S1诱饵蛋白相关检测
3.3 结果
3.3.1 S1基因的扩增、回收及鉴定
3.3.2 pMD19-T-S1载体的构建
3.3.3 pGBKT7-S1的转化及其蛋白表达检测
3.3.4 诱饵蛋白细胞毒性检测
3.3.5 诱饵蛋白自激活检测
3.4 讨论
3.5 小结
第4章 酵母双杂交系统筛选与S1蛋白互作的宿主蛋白
4.1 材料
4.1.1 菌株和质粒
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要实验仪器设备
4.1.4 主要培养基的配制
4.2 方法
4.2.1 检测cDNA文库质量
4.2.2 双杂交对照菌株的准备
4.2.2.1 制备酵母感受态细胞
4.2.3 酵母双杂交筛选
4.2.5 拯救文库质粒
4.3 结果
4.3.1 cDNA文库质量的检测
4.3.2 第一轮酵母双杂交筛选
4.3.3 第二轮酵母双杂交筛选
4.3.4 第三轮酵母双杂交筛选
4.3.5 阳性克隆的鉴定
4.3.6 测序结果
4.4 讨论
4.5 小结
第5章 GST pull-down验证S1蛋白与UBXN1的相互作用
5.1 材料
5.1.1 质粒、菌株和细胞
5.1.2 主要试剂
5.1.3 主要实验仪器
5.1.4 主要试剂的配制
5.2 方法
5.2.1 pGEX-4T-S1重组表达质粒的构建
5.2.1.1 S1基因引物设计
5.2.1.4 S1基因和pGEX-4T-1的双酶切反应
5.2.2 pGEX-4T-S1重组质粒的诱导表达
5.2.3 pGEX-4T-S1融合蛋白的纯化
5.2.2.1 引物的设计
5.2.2.3 RT-PCR为cDNA
5.2.2.3 PCR扩增UBXN1
5.2.2.4 PCR产物的胶回收
5.2.2.5 构建pMD19-T- UBXN1载体
5.2.2.6 pMD19-T-UBXN1的鉴定
5.2.2.7 pMD19-T-UBXN1和pET-28a的双酶切反应
5.2.2.8 双酶切产物的回收纯化
5.2.2.14 pET-UBXN1融合蛋白的表达
5.3 结果
5.3.1 扩增去信号肽的S1基因片段
5.3.2 鉴定重组表达质粒pGEX-4T-S1
5.3.3 小量诱导表达融合蛋白GST-S1
5.3.4 纯化GST-S1融合蛋白
5.3.5 扩增UBXN1基因片段
5.3.6 鉴定重组表达质粒pET-28a-UBXN1
5.3.7 小量诱导表达融合蛋白His-UBXN1
5.3.8 GST-pull down捕获目的蛋白
5.4 讨论
5.5 小结
第6章 UBXN1在宿主细胞的蛋白功能验证
6.1 材料
6.1.1 质粒、菌株和细胞
6.1.2 主要试剂
6.1.3 主要实验仪器
6.1.4 主要试剂的配制
6.2 方法
6.2.1 siRNA片段的设计
6.2.2 IPEC-J2细胞铺板
6.2.3 siRNA干扰
6.2.4 接毒
6.2.5 干扰片段的筛选
6.2.6 荧光定量PCR
6.2.7 MTT空斑形成实验
6.2.8 Western Blot检测
6.3 结果
6.3.1干扰片段的筛选
6.3.2 荧光定量PCR
6.3.3 MTT空斑形成实验
6.3.4 Western Blot检测
6.4 讨论
6.5 小结
第7章 全文总结
参考文献
附 件
在校期间发表的论文及主持课题
致 谢
