TCR基因转染T细胞对ERK、ZAP-70信号蛋白表达及磷酸化影响的研究

摘要

目的 T细胞受体（T cell receptor，TCR）对肿瘤抗原的识别为T淋巴细胞活化提供初始刺激。TCR β的V区有24个亚家族，在正常情况下，机体未受任何抗原刺激，正常人T细胞的TCR β重排应是随机的，即呈多家族性，各家族的T细胞均执行各自的职能。有研究利用RT-PCR检测TCR Vβ 24个亚家族的基因片段而了解正常人和肝癌病人的TCRVβT细胞的表达特点。结果显示健康人PBMC中T细胞受体基因的表达呈随机分布，而肝癌病人的T细胞对于肿瘤细胞的刺激却表现出偏好性。我们以往的研究显示，肝癌患者TCR Vβ7亚家族对于肿瘤细胞的刺激表现出偏好性的扩增，因此我们推测TCRV Vβ7可能与肝癌患者的肿瘤免疫反应有关。我们在之前的研究中发现，TCRVβ7.1基因修饰的T细胞能有效诱导肝癌细胞凋亡，在此基础上本研究构建了人TCRVβ7.1真核表达质粒，转入人T淋巴细胞中表达，进一步研究经TCR基因修饰的T细胞信号通路的激活情况，为今后研究转TCR基因治疗肿瘤以及研究肿瘤患者T细胞免疫耐受的机制奠定了基础。 方法 概括起来说本研究由三部分组成：第一部分为人TCRVβ7.1真核表达质粒的构建；第二部分为研究重组质粒pcDNA3.1(+)/TCRVβ7.1转染T细胞的效率，用流式细胞仪检测TCRVβ7.1表达量；第三部分用ELISA法检测IL-4、INF-γ的表达量，用Western Blot方法检测Erk1/2、Zap-70这两种蛋白总量及磷酸化水平的改变。 结果 (1)扩增出TCRVβ7.1基因，将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)，所构建的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/TCRVβ7.1经酶切、PCR鉴定显示插入片段大小正确；DNA测序结果显示所构建的重组表达载体序列正确。 (2)重组质粒pcDNA3.1(+)/TCRVβ7.1转染人T淋巴细胞后，流式细胞仪检测TCRVβ7.1表达结果显示，转染后的两组细胞TCRVβ7.1表达率明显高于未转染组，说明脂质体介导的基因转染方法可以有效地将TCRVβ7.1基因转入健康人PBMC并得到有效表达。 (3)Western Blot结果显示，转染TCRVβ7.1基因的PBMC组中ERK1/2，p-ERK蛋白表达水平明显高于未转染组(P<0.01)。P-ERK1/2蛋白表达与T激活有关，而p-Zap-70只有在抗原刺激早期有表达。ELISA结果表明，转染组INF-γ水平明显高于未转染组，而IL-4无明显改变。 结论 (1)成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/TCRVβ7.1，并在转染的PBMC中得到有效表达。 (2)首次对转染TCRVβ7.1基因的T淋巴细胞的ERK1/2、Zap-70蛋白表达量和磷酸化水平进行了系统的研究，并对其与细胞因子分泌水平之间的关系作了初步探讨。