陈皮多糖的分离纯化、结构表征及其清除自由基活性研究

摘要

陈皮为芸香科柑桔属植物橘（Citrus reticulate Blanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮，别名橘皮。国内外学者对其主要成分进行了大量的研究，但鲜见其多糖的研究报道。本文选取水溶性陈皮多糖为研究对象，确定其提取和分离纯化工艺，分析分离得到的各组分理化特性，并初步探讨陈皮多糖的体外抗氧化活性，以企为民间医药的深入开发提供理论基础。主要研究内容如下： 1. L9(34)正交法考察陈皮多糖的最佳提取工艺，发现陈皮水溶性多糖的适宜提取条件为固液比1:10、提取温度100℃、提取时间6h，在此条件下多糖提取率为7.61％。为了进一步纯化水提醇沉得到的陈皮粗多糖，采用聚酰胺脱色、Sevag法脱蛋白、透析处理，获得精制多糖（PSP）。含量测定表明PSP总糖含量为17.80％，半乳糖醛酸含量为28.38％，还原糖含量为3.59％，蛋白质含量为0.99％。Β-消除反应说明PSP有O-糖苷连接，刚果红实验说明PSP分子存在螺旋构象。 2. 陈皮多糖PSP经DEAE-cellulose阴离子交换柱梯度洗脱，分离得到四个组分：PSM、PSE、PST、PSF。凝胶渗透色谱与旋光度测定结果表明：四组分为均一多糖，重均分子量依次约为0.8×104 Da、1.1×105 Da、2.1×105 Da及2.1×105 Da；比旋度依次为–128°、+145°、+201°、+189°。单糖组成分析发现：PSM主要含有Glu和Gal，摩尔比为1:1.1；PSE主要含有Ara和Gal，摩尔比为1:1.2；PST主要含有Rha；PSF主要含有Rha、Ara和Gal，摩尔比为1.5:1:1.1。结合TLC对陈皮粗多糖的单糖组成分析结果推断，陈皮多糖是一种组分复杂的杂多糖，单糖组成有6种，其中Rha、Ara、Glu和Gal所占的比例较大。傅里叶红外图谱分析表明：PSM是一种带有结晶水的低分子多糖，结构中存在β-型吡喃糖苷键；PSE、PST和PSF结构相似，是部分羧酸甲酯化的α-半乳糖醛酸多聚糖。 3. 陈皮多糖主组分PST经SephadexG-75凝胶柱层析进一步纯化，得到一亚组分PST-a。凝胶渗透色谱与琼脂糖凝胶电泳分析表明PST-a为单一组分，重均分子量为1.0×105Da。从酸水解、IR、1H-NMR及13C-NMR分析结果推断：PST-a是分支较少的杂多糖，主链由(1→4)-α-D-GalA构成，存在2-O-和3-O-乙酰基，部分半乳糖醛酸被甲酯化，鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖等以α-吡喃糖形式存在于末端或侧链。 4. 以抗坏血酸为阳性对照，采用Fenton反应体系和DPPH自由基对陈皮多糖和黄酮的体外清除自由基活性进行研究。结果显示陈皮多糖与黄酮均有显著的清除DPPH·和OH·的能力，并呈一定的量效关系，表明多糖与黄酮是陈皮的抗氧化活性成分。由SC50值可知，陈皮黄酮对自由基的清除效能接近于抗坏血酸，多糖对自由基的清除能力较前两者低一至两个数量级。