烟草根际抑病土壤有益微生物的组学特征及对青枯病的拮抗作用研究

摘要

土壤是农业生产的基本条件，土壤生态系统的平衡是影响作物健康生长的关键，而土传病害的爆发便是土壤生态系统失衡的最直观表现。随着近年来微生物的研究深入，以微生物学为基础，调节土壤中有益微生物种群，在作物根系形成抵抗病原菌入侵的生物屏障，减少土传病原菌定殖作物根部的可能性与数量，进而达到防治土传病害的目的，被认为是治理土传病害中最友好且可持续的方法。特异抑病型（specific disease suppression）土壤便是以土壤微生物组与植物之间的互作为基础，由某些有益微生物种类异常丰富而产生的。研究特异抑病型土壤中发挥抑病性的关键有益微生物区系，了解它们的特征及功能；在某种程度上，我们可以利用这些关键微生物群落的信息，对处于非抑病环境中的植物进行根际土壤微生物群落改善，设计出适合植物抗病的土壤微生物群落；这样的土壤微生物群落区系能通过促进同病原菌的竞争、拮抗等作用，减少病原菌的有效侵染，从而达到植物健康生长的目的。 青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是一种重要的土传病原细菌，由青枯雷尔氏菌引起的青枯病常常给烟草生产带来毁灭性的损失。化学药剂防治方法给环境带来了不可忽视的负面效应，且收效甚微。传统的生防菌剂开发与应用也面临着难以在土壤或根际土壤中定殖的窘境。抑病型土壤的发现与研究为生物防治措施或能提供新的研究思路。经调查发现重庆植烟区存在长时间连作烟草且维持烟草生长健康、产量达标的土地，本研究选择重庆武隆、彭水、黔江地区长期种植烟草青枯病发病土壤与不发病土壤进行田间样品采集，通过高通量测序和Biolog ECO等方法研究烟草根际土壤微生物组特征；对武隆、彭水、黔江三地及其混合的烟草青枯病发病土进行室内致病特征评价及病原物鉴定，对重庆巫山和彭水地区的不发病土壤进行室内抑病特征评价；对抑制烟草青枯病发生的有益微生物组特性进行研究：判断土壤的抑病能力是否与土壤有益微生物组有关，评价土壤微生物挥发性有机物是否对病原微生物有直接的抑制作用，评价抑病土壤中有益微生物抑病能力的可转移性，评价抑病土壤微生物群落对不同碳源代谢的特性；利用筛选出的抑病土壤和发病土壤分别培育烟草裸种，对抑病土壤有益微生物在烟草根系不同部位的定殖情况进行分析，找到抑病土壤中关键的有益微生物菌属；通过烟草育苗基质与微生物菌剂混合后培育烟种，验证上述研究中筛选出的类芽孢杆菌属等有益微生物组在烟草根部优先定殖后对烟草青枯病的室内及大田防控效果。本学位论文的主要研究结果如下： 1长期连作烟草区域内青枯病发病区与不发病区土壤微生物组特征存在显著差异 选取武隆、彭水、黔江三个区县长期连作烟草青枯病发病与不发病地块，通过田间发病情况调查、常规理化性质测定、土壤微生物群落碳源代谢活性测定和土壤细菌群落结构测定，分析结果发现：各采样地的土壤基本理化性质的差异主要存在于不同区县之间；不发病区域土壤微生物群落对碳源的代谢整体活性高于发病区域土壤；土壤健康状态对根际土壤细菌群落有显著性的影响，说明青枯病的爆发与土壤细菌群落的改变有一定的联系；根际土壤中具有潜在拮抗作用的有益微生物芽孢杆菌属（Bacillus）和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）在不发病土壤中的平均相对丰度大于在发病土壤中。 2初步明确了烟草青枯病抑病土壤的有益微生物组抑病机理 2.1土壤的抑病性主要来源于土壤微生物的活性 对抑病土样进行了高温条件下的抗病盆栽试验，经过高温处理的抑病土壤过氧化氢酶活性显著降低，土壤微生物活性降低，发病率与病情指数升高；经过高压灭菌处理的土壤在青枯菌添加的条件下，烟草青枯病发病率高达100%，说明生物因子是影响土壤抑病性的主要因子，且土壤微生物在其中扮演着关键角色。 2.2抑病土壤有益微生物组的挥发性有机物对青枯病原菌的生长有直接抑制作用 对抑病土壤微生物挥发性有机物影响青枯雷尔氏菌生长进行了评价，分析了在土壤微生物挥发性有机物装置中培养的青枯菌数量和浊度，及其分别与烟草青枯病发病情况的相关性。发现抑病土壤微生物组能通过其挥发性有机物对青枯雷尔氏菌的生长进行抑制，且青枯菌的数量与浊度同烟草发病率和病情指数呈正相关性，进一步证实了抑病土壤抑制烟草青枯病的主要抑病因子为其内在的土壤有益微生物组。 2.3土壤的抑病性可通过有益微生物组进行转移 对抑病土壤微生物组的抑病类型进行了评价。通过混合少量的巫山抑病土壤与大量的发病土壤，然后栽培烟草，烟草青枯病发病率和病情指数得到降低，以混合了20%抑病土壤的处理抑病能力最佳，发病率为41.47%，而没有混合抑病土的发病土壤发病率为91.67%；对烟草根际的青枯雷尔氏菌进行相对定量，发现混合了抑病土的处理青枯菌含量明显低于未添加抑病土的处理，以混合了5%抑病土的处理青枯菌含量最低。说明，抑病土壤的抑病性是可以通过有益微生物组进行转移的。 2.4抑病土壤微生物组具有大量代谢4-羟基苯甲酸和γ-羟基丁酸的能力 收集室内连续种植3茬烟草后的烟草根际抑病土壤与发病土壤，进行土壤微生物群落对Biolog ECO板中31种碳源代谢情况的测定。抑病土壤微生物群落对碳源的整体代谢活性优于发病土壤，其中对4-羟基苯甲酸和γ-羟基丁酸的代谢活性分别是发病土壤的3.37倍和2.43倍，而这两种物质分别代表了连作障碍化感物质和烟草根系分泌物质，说明抑病土壤有益微生物组具有快速代谢连作化感物质和烟草根系分泌物的能力；通过测定土壤微生物群落对酚酸类与羧酸类物质，尤其是对4-羟基苯甲酸和γ-羟基丁酸的利用情况能较好地区分烟草青枯病抑病土壤与发病土壤。 3抑病土壤有益微生物组中潜在的拮抗微生物芽孢杆菌属（Bacillus）和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）更易在烟草根部定殖 对经过灭菌处理和没有灭菌处理的抑病土壤与发病土壤栽培的烟草根部微生物群落结构进行分析。土壤灭菌处理对细菌群落的影响程度为66.2%，而对真菌群落的影响程度为44.6%，说明土壤在灭菌处理后对根部细菌群落定殖的影响大于对真菌群落的影响。结合土壤抑病性在灭菌后丧失的试验结果，推测土壤抑病性来源于烟草根部细菌群落的可能性大于来自真菌群落的可能性。 对抑病土壤与发病土壤处理栽种的烟草根部、根际土壤、块土的细菌与真菌群落结构进行分析。青枯雷尔氏菌所对应的雷尔氏菌属（Ralstonia）在抑病土壤处理中无论是来自烟草根部、根际土壤还是块土，其相对丰度均低于发病土壤处理；在烟草根部具有潜在促生和拮抗作用的真菌群落，在数量上均不能作为解释土壤抑制烟草青枯病的依据；从抑病土壤处理的烟草根部细菌中共筛选出52个OTU作为指示物种，这些OTU分别属于35个属，具有生防潜力的芽孢杆菌属（Bacillus）和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）位列其中，且两者在抑病土壤处理的烟草根部的相对丰度均显著大于发病土壤处理，说明这两个属的菌群在烟草根部定殖对土壤抑制烟草青枯病有一定的指示作用。 4有益微生物菌群优先定殖于烟苗新根能有效防控烟草青枯病 根据报道，选取对青枯雷尔氏菌具有较好拮抗作用的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）和多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），分别代表芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属，以及已经使用于烟草种植的复合微生物菌剂和生物菌肥，将四种微生物菌剂分别与烟草育苗基质混合，然后培育烟种，使有益微生物组能优先定殖于烟根萌发期。将培育的幼苗移栽至烟草青枯病发病土壤中，从室内盆栽试验与大田小区试验分别评价各处理对烟草生长及青枯病防控的影响。通过烟草种子发芽情况测定、烟苗生长情况测定、烟草青枯病发病情况调查、根际土壤微生物群落碳源代谢活性测定，分析结果发现：多粘类芽孢杆菌处理对烟草种子的萌发时间提前了2天，能促进烟草株高、地上部和地下部的生长，对烟草青枯病的室内和大田防效均为各处理中最高，分别为63.64%和24.95%；受多粘类芽孢杆菌影响的根际土壤微生物群落对碳水化合物类、羧酸类、4-羟基苯甲酸和γ-羟基丁酸的代谢能力显著高于对照处理；枯草芽孢杆菌处理在室内对烟草青枯病的防效仅次于多粘类芽孢杆菌，为54.55%，但在大田应用中的防效仅为8.68%。 综上所述，本学术论文以烟草青枯病为例，展示了从抑病型土壤中探索有益微生物组防治烟草青枯病的整个过程：1）烟草青枯病发病与不发病土壤微生物特征解析；2）抑病型土壤有益微生物组的特性、抑病作用及其与烟草根系不同部位互作的关系评价；3）烟根优先定殖有益微生物组对烟草青枯病的防治效果验证。发现了植烟土壤健康状况与土壤细菌群落具有显著相关性，确立了试图通过研究抑病土壤微生物结构以防控烟草青枯病的理论基础。通过对抑病土壤中有益微生物组的特性研究及其与烟草根系互作的研究，筛选出具有拮抗潜力的芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属作为指示烟草青枯病抑病型土壤的有益微生物组，且其抑病作用主要是通过对烟草根部优先定殖来实现的。通过室内与大田试验，验证了类芽孢杆菌属的模式菌株多粘类芽孢杆菌与烟草育苗基质混合后，对烟草生长有促进作用，且对烟草青枯病的防效最佳。本研究结果对于解释抑病型土壤微生物组能在作物根部优先形成以有益微生物组为主的抗病生物屏障具有重要的意义与理论价值，且本研究通过生物信息学分析筛选出的类芽孢杆菌属在烟苗根部优先互作后，对烟草青枯病有较好的控病效果，为实际生产中利用有益微生物组防治土传病害提供了新思路。

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