聚乙二醇修饰海葵神经毒素rhk2a的研究

摘要

聚乙二醇（PEG）修饰蛋白质技术由于能够降低药用蛋白在体内的免疫原性和抗原性、提高药用蛋白在体内的生物利用度，已成功用于改善多种蛋白质药物的性质。2000年中山大学生命科学院利用基因工程技术获得的一种具有心血管活性的专一作用于钠离子通道的毒素多肽——重组海葵神经毒素rhk2a，rhk2a对心脏有非常专一的作用靶点，能对心肌组织产生很强的正性肌力作用，作用强度约为洋地黄类强心药西地兰的3.5倍。在治疗充血性心力衰竭方面有极好的应用前景。为解决海葵肽类毒素rhk2a临床应用时存在的稳定性差，毒性较大等问题，本课题将mPEG修饰技术应用rhk2a。 针对重组海葵神经毒素rhk2a的性质，课题采用mPEG-ALD修饰N－末端氨基。试验建立反向高效液相（RP-HPLC）检测重组海葵神经毒素rhk2a蛋白浓度的方法，并主要采用RP-HPLC法分析PEG修饰产物的组成。以获得最高比例的单修饰产物为目标，采用正交试验优化修饰反应条件。最终选用mPEG-ALD 5K修饰rhk2a：优选的反应条件是pH5.0，rhk2a/mPEG反应摩尔比1:20，反应时间12h，还原剂氰基硼氢化钠的添加量为30μl。在四个影响因素中，对mPEG-ALD修饰rhk2a反应影响最大的是反应溶液的pH值，而影响最小的因素是反应时间。修饰产物用SP-650S阳离子交换层析法分离纯化，并超滤除盐、冻干浓缩后得到最终产物。 对修饰产物进行了分子量、稳定性、纯度的测定，并建立急性心力衰竭豚鼠模型，分别对比去乙酰毛花苷注射液、重组海葵神经毒素rhk2a和mPEG-rhk2a溶液对心衰豚鼠的LVSP、±dp/dpmax的影响。研究表明，分离纯化后获得的产物中单一PEG修饰海葵神经毒素rhk2a占83.287％，经MALDI-TOF-MS法检测该产物为单修饰。与未修饰rhk2a相比，其室温及37℃存放条件下，稳定性得到很好的改善；对于心衰豚鼠，三种药物均能提高衰竭心脏的心肌收缩力，改善心功能，而海葵神经毒素rhk2a溶液和mPEG-rhk2a溶液作用均比去乙酰毛花苷注射液强。重组海葵神经毒素rhk2a给药后起效时间快，强心作用明显高于其他两组药物。mPEG-rhk2a溶液组LVSP值、－dp/dtmax值在10min 内呈缓慢上升趋势，给药20min后作用最强。