葡萄籽原花青素通过线粒体途径诱导鼻咽癌CNE-2细胞凋亡的研究

摘要

目的： 本研究主要是通过探索具有生物活性的葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins，GSPs）对鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）细胞株CNE-2的增殖，周期及凋亡的作用效应以及其潜在的相关机制，为葡萄籽原花青素未来应用于鼻咽癌的临床治疗提供依据。 方法： 1.细胞增殖能力是用 CCK8试剂盒法和平板克隆形成实验来研究的。用GraphPad Prism5.0软件分析GSPs对CNE-2细胞的IC50；用药物作用于平板中细胞培养十天后计算其克隆形成率。 2.细胞周期分析是运用溴化丙啶单染法检测GSPs对CNE-2细胞周期分布的影响。 3. CNE-2凋亡细胞核的改变是用Hochest33258染色，荧光显微镜采集图像观察对比，随后采用Annexin V-FITC/PI双染检测不同浓度GSPs对CNE-2细胞凋亡率的影响。 4.细胞线粒体膜电位(Mitochondrialmembrane potential,MMP)的检测是用JC-1染色液给经不同浓度GSPs作用后的CNE-2细胞染色，流式细胞仪检测其线粒体膜电位的改变。 5.运用Western blotting检测不同浓度GSPs作用后CNE-2细胞内Bax、Bim、Bak、Bcl-2、Bcl-xL、caspase-3和ADP核糖聚合酶（PRAP）等相关凋亡蛋白表达的变化，并使用ImageJ软件分析各种蛋白相对表达量的改变。 6.数据结果采用 SPSS17.0统计软件的单因素方差分析统计分析，Adobe Photoshop CS6软件整理图片。 结果： 1. CCK8实验显示GSPs以时间和剂量依赖性方式抑制CNE-2细胞增殖。原花青素对CNE-2细胞的IC50在6、12、24小时分别为80.19、34.78、14.48μg/ml。随着GSPs浓度的升高，CNE-2细胞克隆能力逐渐减低。 2.不同浓度(10、20、40μmol/ L)的GSPs能够诱导CNE-2细胞发生周期G2/M期的阻滞，并呈现剂量依赖性。 3. Hochest33258染色实验显示CNE-2凋亡细胞在荧光显微镜下可见到深染、固缩、碎裂的凋亡形态细胞核；Annexin FITC-PI双染法结果显示不同浓度GSPs 诱导的CNE-2细胞总凋亡率随着GSPs浓度的增加而显著升高。 4. JC-1染色结果显示CNE-2细胞经GSPs处理后线粒体膜电位逐渐降低，呈现剂量依赖性。 5.Western blotting实验结果显示线粒体相关促凋亡蛋白Bax、Bim、Bad、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP表达上调，相关抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、pro-caspase-3和PARP表达下调。 结论： 葡萄籽原花青素在体外呈剂量和时间依赖性的抑制鼻咽癌 CNE-2细胞的增殖，引起其细胞周期G2/M期阻滞，引起相关凋亡蛋白的表达变化并通过线粒体凋亡途径诱导其凋亡。本研究证明GSPs在体外可明显抑制CNE-2细胞生长并诱导其凋亡，为GSPs有潜力作为一种具有生物活性的鼻咽癌治疗药物提供了实验依据。

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1 前 言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

2.材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 GSPs抑制CNE-2细胞的增殖

3.2 GSPs诱导CNE-2细胞周期G2/M期阻滞

3.3 GSPs可诱导鼻咽癌CNE-2细胞凋亡

3.4 GSPs可促使鼻咽癌CNE-2细胞线粒体膜电位降低

3.5 GSPs可诱导鼻咽癌CNE-2细胞内相关凋亡蛋白表达的改变

4 讨论

小结

参考文献

综述:BH3-only蛋白在肿瘤治疗中的研究进展

致谢

附录Ⅰ缩写词中英文对照

附录Ⅱ 在读期间科研情况