微血管内皮细胞膜微粒对星形胶质细胞和血脑屏障功能的调节及对缺血性脑卒中的影响

摘要

【目的】 1.研究正常培养条件下及缺氧无糖条件下提取的内皮细胞膜微粒（EMVs）对星形胶质细胞增殖、凋亡的影响及相关的分子机制。 2.探讨不同条件下培养获得的EMVs与星形胶质细胞共培养后对血脑屏障的通透性的影响。 3.探讨不同条件下培养获得的EMVs对脑缺血损伤及脑血流灌注的影响。 【方法】 提取人脑微血管内皮细胞（HBMECs）膜微粒EMVs，利用纳米颗粒分析仪(NTA)检测EMVs颗粒直径的大小及浓度，并采用流式细胞仪检测EMVs表面标记。采用PKH26对EMVs进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察EMVs与星形胶质细胞结合情况。将HBMECs通过正常培养及缺氧无糖培养提取得到两种环境下释放的EMVs，分别命名为n-EMVs，OGD-EMVs。采用MTT法检测n-EMVs/OGD-EMV对星形胶质细胞增殖的影响；运用Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒结合流式细胞仪检测n-EMVs/OGD-EMV对星形胶质细胞凋亡率的影响；采用激光激光共聚焦显微镜及Western blot检测n-EMVs/OGD-EMV对星形胶质细胞特异性GFAP表达的影响，分析 PI3K、Akt、Caspase-9及Bcl2的表达水平。利用PI3K阻断剂LY294002阻断PI3K/Akt通路后检测EMVs对星形胶质细胞通路蛋白的调控及增殖的影响。建立HBMECs和星形胶质细胞共培养的血脑屏障体外模型，通过伊文思蓝染料渗透实验检测n-EMVs、OGD-EMV对BBB体外模型通透性的影响，并用western blot方法检测内皮细胞紧密连接蛋白zonula occudens-1（ZO-1）和Claudin-5的表达。 PKH26标记的EMVs尾静脉输入小鼠体内，24h后取脑制作冰冻组织切片，用GFAP标记星形胶质细胞，免疫荧光显微镜分析EMVs-星形胶质细胞的融合。通过短暂性中动脉闭塞（tMCAO）构建小鼠血脑缺血损伤模型，术后第二天小鼠尾静脉注射伊文思蓝染料评估血脑屏障受损的情况。小鼠tMCAO术后尾静脉注射各组EMVs或对照PBS。伊文思蓝渗透量评估BBB损伤。用2.5%异拂烷对小鼠进行麻醉，麻醉后切开小鼠颅盖骨的皮肤，使整个颅骨暴露并运用激光多普勒血流仪扫描1min。最后进行平均脑血流量分析，评估EMVs对脑血流灌注的影响。利用TTC染色观察脑梗死面积的大小。使用longa5分方法评估小鼠神经功能缺损。神经功能缺损评分有5分：0=无神经功能损伤；1=右前肢伸展障碍；2=向右打圈；3=行走时右侧倾倒；4分=意识昏迷。 【结果】 1. EMVs的特性检测：EMVs表达细胞膜微粒表面标记Annexin V、血管内皮细胞特异性标记CD31及CD144；EMVs粒径为100-400纳米；同时，正常条件培养的内皮细胞的培养基中含有（8.3±0.01）×108/ml EMVs。 2.激光共聚焦显微镜观察到PKH26染色的EMVs和星形胶质共培养能够与星形胶质细胞相结合。 3. n-EMVs促进星形胶质细胞增殖，增加了星形胶质细胞特异性蛋白GFAP的表达(P<0.01)，同时，上调了PI3K和Akt蛋白表达(P<0.01)；利用PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt通路发现，阻断剂LY294002可消除n-EMVs对星形胶质细胞增殖、AKt及p-AKt蛋白表达的促进作用。与此相反，OGD-EMVs抑制星形胶质细胞增殖，降低了星形胶质细胞 GFAP的表达(P<0.01)，同时，下调了PI3K和Akt蛋白表达(P<0.01)。 4.流式细胞仪结果显示n-EMVs抑制而OGD-EMVs促进星形胶质细胞的凋亡(P<0.01)；另外，n-EMVs促进星形胶质细胞Bcl2表达，抑制了蛋白Caspase-9的表达(P<0.01)，OGD-EMVs则发挥着相反的作用(P<0.01)。 5.星形胶质细胞经n-EMVs处理之后与HBMECs共培养构建BBB体外模型。与对照PBS处理组相比，BBB通透性降低(P<0.01)，紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5表达上调(P<0.01)，OGD-EMVs则具有相反的作用(P<0.01)。 6. EMVs体内能够与小鼠脑组织中星形胶质细胞结合。 7.伊文思蓝染料渗透性检测tMCAO小鼠血脑屏障的破坏，结果发现尾静脉注射n-EMVs可减低tMCAO小鼠伊文思蓝的渗透量，促进BBB功能恢复；而注射OGD-EMVs加剧BBB损伤。(P<0.01)。 8.尾静脉注射n-EMVs能够增加脑血流，降低神经缺损评分，减少脑缺血损伤面积；而OGD-EMVs输注减少脑血流，增加神经缺损评分，增加脑缺血损伤面积(P<0.01)。 【结论】 1. n-EMVs通过PI3K/Akt信号通路促进星形胶质细胞增殖，增强GFAP表达；同时，通过上调抗凋亡蛋白bcl2和下调促凋亡蛋白caspase-9抑制细胞凋亡。而OGD-EMVs具有相反的作用。 2. n-EMVs能够上调紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5的表达，减少血脑屏障渗透性，帮助受损BBB恢复；而OGD-EMVs具有相反的作用。 3.注射n-EMVs能够减少脑梗死面积，减轻神经缺损、增加脑血流量。而注射OGD-EMVs加重小鼠的脑缺血损伤。