利用体内噬菌体展示技术筛选及鉴定肺癌特异性结合多肽

摘要

肺癌是世界范围内最常见、致死人数最多的恶性肿瘤之一，可分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)两种，其中非小细胞肺癌约占肺癌总数的80％。由于肺癌起病隐匿，肺癌的筛查和治疗方面没有得到根本的改善，患者出现症状时多为晚期，预后较差，肺癌的5年存活率仅为13％；80％的患者在诊断后1年内死亡。而肺癌的早期诊断患者的5年存活率可达60％～90％。因此，积极寻找肺癌早期诊断的特异性标志物是提高肺癌治疗效果的根本所在；同时，对于中晚期肺癌，加速靶向治疗药物的研发是克服当前肺癌化疗高毒、低疗效的有效手段。 目的：以肺癌细胞A549为研究目标，利用体内噬菌体展示技术筛选出与肺癌特异性结合的多肽，为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础。 方法：首先，我们将肺癌细胞A549 接种于裸鼠体内，待其荷瘤成功并增殖到一定程度，采用体内噬菌体肽库展示技术，将肽库静脉注射入荷瘤裸鼠体内，然后筛选与肺癌组织特异性结合的含外源多肽的噬菌体，经过3轮体内筛选。然后，随机挑取一批第3轮筛选后的噬菌体单克隆，采用ELISA及细胞免疫化学鉴定噬菌体对肺癌细胞A549的亲和力。挑取阳性克隆扩增，按照分子克隆上的方法提取噬菌体单链DNA，送测序公司进行序列测定，根据测序结果获得各噬菌体外源多肽的核苷酸序列，对获得的多肽进行生物信息学分析。接下来进行多肽的特异性鉴定，首先，通过化学合成多肽并标记荧光FITC。然后，利用荧光标记多肽鉴定多肽与肺癌细胞及组织结合的特异性、亲和力、体内分布等。利用细胞免疫荧光鉴定多肽对肺癌细胞A549、NCI-H1299、肝癌细胞7402、HepG2、肺正常细胞WI-38、肝正常细胞LO2的亲和力。利用组织免疫荧光鉴定多肽对肺癌组织、肺正常组织的结合。利用荧光多肽在荷瘤裸鼠体内分布实验鉴定多肽在荷瘤裸鼠的靶向性分布。 结果：经3 轮体内筛选，噬菌体在肿瘤组织中富集了104 倍。随机挑取第3 轮筛选后的30个噬菌体单克隆，分别命名为phage-1、phage-2、…，phage-30，采用ELISA 鉴定噬菌体对肺癌细胞A549的亲和力，成功获得了对A549 有较高亲和力噬菌体克隆27个，其中，P/N>2.5以上的有17个克隆，而在上述17个克隆中，P/N>3.0的克隆有4个，分别是phage-1、phage-12、phage-14和phage-20，同时，细胞免疫化学鉴定这4个克隆对A549的亲和力，与正常对照组相比，DAB染色呈显著阳性。将ELISA 鉴定后的P/N>2.5的噬菌体克隆共17个扩增，测序，根据测序结果获得噬菌体外源多肽的核苷酸序列，其中有14个噬菌体克隆分别插入了6 条不同的外源多肽核苷酸序列，分别命名为zp1，zp2，zp3，zp4，zp5,zp6，另外还有3个噬菌体克隆测序结果显示其外源多肽序列丢失（空噬菌体）。测序结果显示多肽zp2 重复频率最高，达到50％，且生物信息学分析其在国内外文献尚未见报道，其功能也属未知，故我们拟对多肽zp2 进行系统研究。通过化学合成多肽zp2 全长，并标记荧光FITC（zp2-FITC）。细胞免疫荧光实验显示，zp2-FITC 对肺腺癌细胞A549具有较强亲和力，并且也发现，其对肺鳞癌细胞NCI-H1299 同样有较强亲和力，对肝癌细胞7402、HepG2的结合较弱，但对肺正常细胞WI-38、肝正常细胞LO2 亲和力不强。组织免疫荧光实验显示，zp2-FITC对临床肺癌组织的结合显著高于正常对照组。裸鼠体内分布实验显示，zp2-FITC在荷瘤裸鼠肿瘤部位分布较多，有较好的靶向性，其次，在肝脏、肾脏组织也有分布，可能与其是主要的代谢器官有关，但是在裸鼠大脑、心脏、肺脏等正常组织未见及分布。 结论：(1) 成功建立了裸鼠荷瘤模型；(2) 利用上述模型，在体内成功筛选出与肺癌组织特异性结合的噬菌体；(3) 利用ELISA和细胞免疫化学鉴定出27个噬菌体单克隆对A549 有高度特异性和亲和力；(4) 经过DNA 测序，获得了6 条多肽序列，分别命名为zp1、zp2…zp6，经生物信息学分析发现，zp2 尚未见研究报道，本课题对zp2 进行了系统研究；(5) 利用细胞免疫荧光和组织免疫荧光鉴定了多肽zp2 对人肺癌细胞、组织具有较高特异性和亲和力，裸鼠体内分布实验显示多肽zp2具有显著的肿瘤靶向性。