钙离子对高基质金属蛋白酶-9状态下心肌成纤维细胞的影响

摘要

研究背景:
　　心室重构(ventricular remodeling)是多种心血管疾病心脏功能由代偿向失代偿转变的重要病理生理基础。探讨心室重构的发生发展机制,从而阻逆心室重构的发生,对改善心血管病患者预后具有重要的意义。
　　心室重构包括心肌细胞和细胞外基质(extracellar matrix,ECM)重构,前者为心肌细胞本身结构、代谢及功能异常改变,后者主要是指心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)增殖和胶原网络的含量及组成发生改变。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组内源性蛋白酶的家族,存在于多种组织中,并具有降解细胞外基质等功能。近年研究发现,心肌组织中也存在多种MMP,其中MMP-9是心肌组织中含量较高的MMP。既往研究显示,一些心血管疾病演变过程中存在MMP-9表达增高,同时伴有心肌ECM成分发生变化、心肌纤维化、室壁顺应性降低、心功能异常等心室重构表现。例如:心肌梗死后心肌组织中MMP-9表达升高,左心室扩大,敲除MMP-9基因后心室扩大改善。Chua等研究发现扩张型心肌病大鼠心肌组织中MMP-9表达升高,心肌纤维化明显,心肌收缩力下降。可见MMP-9表达增高与某些心血管疾病心室重构可能有密切关系。另一方面,有研究显示,钙离子对多种组织MMP-9的表达和组织重构存在影响,例如:Jiang等发现增加肝癌细胞钙离子内流能促进其MMP-9的释放与激活;Hwang等发现通过使用钙离子螯合剂减少肿瘤细胞内钙离子能抑制MMP-9的分泌;Shen X.C.等对去甲肾上腺素诱导的小鼠心肌肥厚模型研究发现,用藏红花素使心肌细胞内钙离子减少,能降低心肌细胞MMP-9表达并改善心室重构;杨永健等在心肌梗死大鼠模型中使用钙离子通道阻滞剂阿莫地平和米贝拉地尔,结果发现两种钙离子通道阻滞剂均能抑制心肌组织MMP-9的表达,减少细胞外基质纤维连接蛋白的降解,改善心室重构等等。心肌成纤维细胞作为心肌间质中的主要细胞(占心肌间质细胞90％以上),能合成和分泌多种活性物质,调节胶原含量,在心肌细胞外基质重构中占重要地位。然而,钙离子能否对心肌成纤维细胞的MMP-9表达、成纤维细胞增殖和胶原代谢产生同样的影响却少见报道。钙离子作为机体的一种电解质存在于多种组织,包括心肌组织。在一些心血管疾病,如,心肌梗死、高血压、心肌病等,往往存在心肌组织高MMP-9状态和高钙状态(例如,缺血再灌注、炎症等可造成局部钙超负荷)。因此研究在高MMP-9状态下,钙离子对心肌成纤维细胞的MMP-9表达、成纤维细胞增殖和胶原代谢、对MMP-9活性的影响,将有助于进一步阐明某些心血管疾病状态下心室重构机制及寻求新的治疗靶点。
　　目的:
　　探讨不同细胞钙离子浓度对高MMP-9状态下心肌成纤维细胞的影响及其作用机制,为进一步阐明心室重构的发病机制提供依据,同时为心室重构寻求新的治疗途径。
　　材料与方法:
　　1.MMP-9、氯化钙(CaCL2)以及MMP-9+CaCL2对心肌成纤维细胞(CFs)增殖影响的研究
　　将2-3代的wistar大鼠乳鼠心肌成纤维细胞(CFs)以1×106/孔的细胞密度接种于96孔板,按以下方式分组,每组设置3个复孔,加入相应培养液孵育24小时后,使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖情况。具体分组如下:
　　1.1、MMP-9对CFs增殖影响的研究
　　分为:
　　①对照组(加入单纯培养液10μl);
　　②40nM MMP-9组(加入MMP-9终浓度为40nmol/L的培养液10μl);
　　③200nM MMP-9组(加入MMP-9终浓度为200nmol/L的培养液10μl);
　　④1μM MMP-9组(加入MMP-9终浓度为1μmol/L的培养液10μl);
　　⑤5μM MMP-9组(加入MMP-9终浓度为5μmol/L的培养液10μl)。
　　1.2、CaCL2对CFs增殖影响的研究
　　分为:
　　①对照组(加入单纯培养液10μl);
　　②0.2mM CaCL2组(加入CaCL2终浓度为0.2mmol/L的培养液10μl);
　　③0.4mM CaCL2组(加入CaCL2终浓度为0.4mmol/L的培养液10μl);
　　④0.8mM CaCL2组(加入CaCL2终浓度为0.8mmol/L的培养液10μl)。
　　1.3、MMP-9+CaCL2对CFs增殖影响的研究
　　分为:
　　①对照组(加入单纯培养液10μl);
　　②模型组(加入MMP-9终浓度为200nmol/L的培养液10μl);
　　③0.2mM CaCL2+MMP-9组(加入MMP-9终浓度为200nmol/L、CaCL2终浓度为0.2mmol/L的培养液10μl);
　　④0.4mM CaCL2+MMP-9组(加入MMP-9终浓度为200nmol/L、CaCL2终浓度为0.4mmol/L的培养液10μl);
　　⑤0.8mM CaCL2+MMP-9组(加入MMP-9终浓度为200nmol/L、CaCL2终浓度为0.8mmol/L的培养液10μl)。
　　2.不同Ca2+浓度对高MMP-9状态下心肌成纤维细胞MMP-9和胶原表达影响的研究
　　从以上实验基础上选择200nmol/L的MMP-9为高MMP-9状态,建立高MMP-9状态模型。将心肌成纤维细胞(CFs)接种于25cm2的细胞培养瓶,使细胞密度为1×106个/瓶。贴壁后换无血清的RPMI-1640培养液培养24h后分为:
　　①对照组(加入单纯培养液5ml);
　　②钙离子螯合剂(BAPTA-AM)组(加入BAPTA-AM终浓度为10μmol/L、MMP-9终浓度为200nmol/L的培养液5ml);
　　③模型组:(加入MMP-9终浓度为200nmol/L的培养液5ml);
　　④0.2mM CaCL2+MMP-9组(加入MMP-9终浓度为200nmol/L、CaCL2终浓度为0.2mmol/L的培养液5ml);
　　⑤0.4mM CaCL2+MMP-9组(加入MMP-9终浓度为200nmol/L、CaCL2终浓度为0.4mmol/L的培养液5ml);
　　⑥0.8mM CaCL2+MMP-9组(加入MMP-9终浓度为200nmol/L、CaCL2终浓度为0.8mmol/L的培养液5ml);
　　⑦维拉帕米组(加入MMP-9终浓度为200nmol/L、CaCL2终浓度为0.8mmol/L、维拉帕米终浓度为50μmol/L的培养液5ml)。
　　孵育24小时后,提取细胞蛋白和RNA,用免疫印迹法(western blotting)检测孵育物中MMP-9以及Ⅰ型(collagen I)、Ⅲ型胶原(collagen III)水平;QRT-PCR法检测细胞中MMP-9mRNA和collagen I及collagen III mRNA的表达和用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度变化。
　　3.不同Ca2+浓度对MMP-9活性影响的研究
　　将MMP-9分成3组,每组MMP-9的量为1μg,加入不同浓度的CaCL2相互作用30min后用明胶酶谱法检测MMP-9的活性。分组情况如下:
　　①对照组(加入单纯培养液0.5ml);
　　②0.4mM CaCL2组(加入CaCL2终浓度为0.4mmol/L的培养液0.5ml);
　　③0.8mM CaCL2组(加入CaCL2终浓度为0.8mmol/L的培养液0.5ml)。
　　结果:
　　1.MMP-9对心肌成纤维细胞增殖的影响
　　随着MMP-9浓度的升高,从对照组、40nM MMP-9组、200nM MMP-9至1μM MMP-9组心肌成纤维细胞增殖依次升高,组间比较(p<0.05),但MMP-9浓度达到5μM时心肌成纤维细胞增殖较1μM MMP-9组低(p<0.05),与200nM MMP-9组相仿(p>0.05)。
　　2.不同Ca2+浓度对心肌成纤维细胞增殖的影响
　　不同CaCL2浓度组之间心肌成纤维细胞增殖情况无明显差异(p>0.05)。
　　3.不同Ca2+浓度对高MMP-9状态下心肌成纤维细胞增殖的影响
　　在高MMP-9状态下,加入不同浓度Ca2+后,随着Ca2+浓度的升高,CFs增殖有逐渐升高的趋势,但仅当Ca2+浓度为0.8mM时CFs增殖才明显高于对照组(p<0.05)。
　　4.不同Ca2+浓度对心肌成纤维细胞MMP-9、collagen I、collagen III表达的影响。
　　4.1、不同Ca2+浓度对心肌成纤维细胞MMP-9表达的影响
　　在高MMP-9状态下,随着ca2+浓度升高,对照组、BAPTA-AM组、模型组、0.2mM CaCL2+MMP-9组至0.8mM CaCL2+MMP-9组的MMP-9mRNA表达依次增高,组间比较差异显著(p<0.05),使用维拉帕米干预后,MMP-9mRNA表达明显降低(与0.8mMCaCL2+MMP-9组比较p<0.01),与对照组相仿(p>0.05)。MMP-9蛋白表达从模型组、0.2mM CaCL2+MMP-9组、0.4mM CaCL2+MMP-9组至0.8mM CaCL2+MMP-9组依次增高,组间比较差异显著(p<0.05)。使用BAPTA-AM干预后,MMP-9的表达降低(与模型组比较p<0.05),与对照组相近似(p>0.05)。使用维拉帕米干预后,MMP-9的表达降低(与0.8mM CaCL2+MMP-9组比较p<0.05),与对照组比较无明显差异(p>0.05)。
　　4.2、不同Ca2+浓度对collagenI表达的影响
　　在高MMP-9状态下,随着Ca2+浓度升高,collagen I mRNA表达从对照组、模型组、0.2mM CaCL2+MMP-9组、0.8mM CaCL2+MMP-9组表达依次增高,组间比较有统计学差异(p<0.05),使用BAPTA-AM干预后,collagen I mRNA的表达降低(与模型组比较p<0.001)。使用维拉帕米干预后,collagen I mRNA的表达降低(与0.8mM CaCL2+MMP-9组比较p<0.001),并低于对照组(p<0.001)。collagen I蛋白表达从对照组、BAPTA-AM组、模型组、0.2mM CaCL2+MMP-9组、0.4mM CaCL2+MMP-9组、0.8mM CaCL2+MMP-9组逐渐降低,组间比较有统计学差异(p<0.05),使用维拉帕米干预后,collagen I蛋白表达较0.8mM CaCL2+MMP-9组升高(p<0.01),但仍低于对照组(p<0.05)。
　　4.3、不同Ca2+浓度对collagen III表达的影响
　　在高MMP-9状态下,随着Ca2+浓度升高,collagen III mRNA表达从对照组、模型组、0.2mM CaCL2+MMP-9组、0.8mM CaCL2+MMP-9组表达依次增高,组间比较有显著差异(p<0.05),使用BAPTA-AM干预后,collagen III mRNA的表达降低(与模型组比较p<0.001)。使用维拉帕米干预后,collagen III mRNA的表达降低(与0.8mM CaCL2+MMP-9组比较p<0.001),并低于对照组(p<0.001)。而各组collagen III蛋白表达均低于对照组(p<0.05),组间比较无明显差异(p>0.05)。使用维拉帕米干预后collagen III蛋白表达升高(与0.8mMCaCL2+MMP-9组比较p<0.05),但仍低于对照组(p<0.05)。
　　以上各组细胞内钙离子浓度(以下用[Ca2+]i表示)的变化由模型组到0.8mM CaCL2+MMP-9组依次升高,组间比较有统计学差异(p<0.05);模型组与对照组相仿(p>0.05)。使用BAPTA-AM干预后,[Ca2+]i降低(与模型组比较p<0.05)。使用维拉帕米干预后,[Ca2+]i降低(与0.8mM CaCL2+MMP-9组比较p<0.001),并与对照组相仿(p>0.05)。
　　5.[Ca2+]i与MMP-9表达水平的相关性分析
　　[Ca2+]i与MMP-9蛋白水平呈正相关(r=0.884p<0.001),与MMP-9mRNA水平呈正相关(r=0.950P<0.001))。
　　6.[Ca2+]i和MMP-9与Ⅰ、Ⅲ型胶原的相关性分析
　　[Ca2+]i与Ⅰ型胶原mRNA表达呈正相关(r=0.698p<0.001)与Ⅰ型胶原蛋白表达呈负相关(r=-0.913p<0.001);MMP-9与Ⅰ型胶原mRNA表达呈正相关(r=0.841p<0.001)与Ⅰ型胶原蛋白表达呈负相关(r=-0.942p<0.001);偏相关分析显示,在控制MMP-9因素后,[Ca2+]i与Ⅰ型胶原mRNA表达呈负相关(r=-0.599p<0.01)与Ⅰ型胶原蛋白表达呈负相关(r=-0.512p<0.05)。在控制[Ca2+]i因素后,MMP-9与Ⅰ型胶原mRNA表达呈正相关(r=0.796p<0.001);MMP-9与Ⅰ型胶原蛋白表达呈负相关(r=-0.707p<0.001)。
　　[Ca2+]i与Ⅲ型胶原mRNA表达呈正相关(r=0.733p<0.001)与Ⅲ型胶原蛋白表达呈负相关(r=-0.721p<0.001);MMP-9与Ⅲ型胶原mRNA表达呈正相关(r=0.868p<0.001)与Ⅲ型胶原蛋白表达呈负相关(r=-0.707p<0.001);偏相关分析显示,在控制MMP-9因素后,[Ca2+]i与Ⅲ型胶原mRNA表达呈负相关(r=-0.599p<0.01)与Ⅲ型胶原蛋白表达无显著相关(r=-0.290p>0.05)。在控制[Ca2+]i因素后,MMP-9与Ⅲ型胶原mRNA表达呈正相关(r=0.812p<0.001)与Ⅲ型胶原蛋白表达无显著相关(r=-0.215p>0.05)。
　　[Ca2+]i与Ⅰ/Ⅲ型胶原比值呈负相关(r=-0.915p<0.001),MMP-9与Ⅰ/Ⅲ型胶原比值呈负相关(r=-0.942p<0.001)。偏相关分析显示,在控制MMP-9因素后,[Ca2+]i与Ⅰ/Ⅲ型胶原比值呈负相关(r=-0.522p<0.05)。在控制[Ca2+]i因素后,MMP-9与Ⅰ/Ⅲ型胶原比值呈负相关(r=-0.722p<0.001)。
　　7.不同Ca2+浓度对MMP-9活性的影响
　　MMP-9的活性随Ca2+浓度升高而降低,组间比较有统计学差异(p<0.001)。
　　结论:
　　1.钙离子能使高MMP-9状态下心肌成纤维细胞增殖。
　　2.钙离子能抑制MMP-9的活性。
　　3.钙离子能促进心肌成纤维细胞MMP-9的合成与表达,从而降解Ⅰ、Ⅲ型胶原,使Ⅰ/Ⅲ胶原比例降低。
　　4.钙通道阻滞剂和钙离子螯合剂能通过降低细胞内钙离子浓度,降低心肌成纤维细胞MMP-9的合成与表达。

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声明

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中文摘要

英文摘要

引言

材料与方法

1. 材料

2. 方法

3.统计学分析

实验结果

1. MMP-9对心肌成纤维细胞增殖的影响

2. 不同Ca2+浓度对心肌成纤维细胞增殖的影响

3. 不同Ca2+浓度对高MMP-9状态下心肌成纤维细胞增殖的影响

4.不同Ca2+浓度对MMP-9及I型、III型胶原蛋白表达的影响。

5.不同Ca2+浓度对MMP-9及I型、III型胶原mRNA表达的影响

6.心肌成纤维细胞内钙离子浓度的变化

7.钙离子与MMP-9表达水平的相关性

8. [Ca2+]i 和MMP-9与Ⅰ、Ⅲ型胶原的相关性

9. 不同Ca2+浓度对MMP-9活性的影响

讨论

1. MMP-9、氯化钙（CaCL2）以及 MMP-9+CaCL2对心肌成纤维细胞（CFs）增殖的影响

2. 不同Ca2+浓度对心肌成纤维细胞MMP-9合成及表达的影响

3.不同Ca2+浓度对心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原合成与表达的影响

4. 不同Ca2+浓度对心肌成纤维细胞Ⅲ型胶原合成与表达的影响

5. 不同Ca2+浓度对心肌成纤维细胞Ⅰ/Ⅲ型胶原比例的影响

6.钙离子对MMP-9活性的影响

展望

结论

参考文献

综述

攻读学位期间主要研究成果

中英文缩略语对照

致谢