小叶榕抗炎药效物质基础及其质量控制方法研究

摘要

小叶榕叶是桑科植物榕属小叶榕（Ficus microcarpa）的干燥叶子，以水提物干浸膏作为主成分的咳特灵胶囊收载在部颁标准《中华人民共和国卫生部药品标准》（中药成方制剂第十四分册）中，其用于治疗哮喘和慢性支气管炎症，临床疗效确切，考虑到中药的多成分和整体作用，应用指纹图谱方法控制中药提取物中尽量多的成分，但是中药疗效是多个功能组分的整体表现，是多成分、多靶点协同作用的结果，既不是单一成分作用，也不是多种成分简单相加。本文研究的质量控制模式在化学成分和药效研究基础上，阐明了“成分与药效之间的关联性”建立中药中的某一或几个有效成分的定性、定量分析方法，从而建立科学合理的质量控制方法，符合中药现代化的要求。主要研究内容：
　　1.采用LPS刺激巨噬细胞RAW264.7，建立体外的炎症模型，采用MTT法检测小叶榕叶水提物及不同极性部位对RAW264.7巨噬细胞的毒性作用；Griess法分析培养液中NO含量；采用 ELISA法检测培养液中TNF-α表达情况。结果表明LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后，培养液中炎症介质NO和TNF-α含量显著增加，小叶榕叶水提物及不同极性部位对上述炎症介质的释放具有不同程度的抑制作用，小叶榕叶可能通过抑制炎症介质NO和TNF-α释放而发挥抗炎作用；综合比较炎症介质NO和TNF-α释放大小，可以判断乙酸乙酯层萃取物和水层萃取物均能抑制相关因子的释放，实验结果可为下一步小叶榕叶化学成分提取分离研究提供参考。
　　2.应用血清药物化学的方法，对小叶榕入血成分进行分析，为小叶榕药效物质基础研究奠定基础，建立小叶榕体外指纹图谱以及大鼠灌胃后含药血清的HPLC指纹图谱分析方法；通过对比体内外指纹图谱，确定入血部位，为下一步进行入血成分的分析以及化学成分的分离缩小分析范围。结果表明含药血清中显示出7个入血成分，大致确定其入血部位主要在乙酸乙酯层，入血成分群极性部位的确定为后期的药效物质的研究指明了方向。
　　3.对小叶榕叶抗炎有效部位的化学成分进行提取分离并对其结构进行鉴定，同时对得到的化学成分进行活性筛选和评价。采用硅胶柱层析对有效部位的成分进行分离纯化，利用IR、1H-NMR、13C-NMR等技术对单体化合物进行结构鉴定。采用LPS刺激巨噬细胞RAW264.7来建立体外炎症反应模型，运用MTT法检测各单体化合物对RAW264.7巨噬细胞的毒性作用；Griess法分析培养液中NO量；采用ELISA法检测培养液中TNF-α表达情况。结果得到10个化合物，通过各单体成分对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞释放炎症因子NO和TNF-α的表达情况，与模型组比较，药效试验发现小叶榕发挥抗炎药效的作用可能是多成分、多指标协同作用的结果，该结果为进一步揭示小叶榕抗炎药效物质基础提供可靠地理论指导和数据支撑。
　　4.研究不同采收期小叶榕叶的指纹图谱，为鉴定小叶榕药材提供依据，此外，也为确定最佳采收期提供参考。以29号峰对羟基苯甲酸仲丁酯作为参照峰将指纹图谱分为高极性和低极性两部分进行表达。利用高效液相色谱法测定不同采收期的12个样品的色谱图谱，在测定的12批药材中，总共有约55个色谱峰，其中图谱显示有44个峰为12批样品所共有，确定为特征指纹峰。同时，利用统计学软件将12批药材中的44个共有峰与药效数据NO和TNF-α的抑制率进行相关分析和回归分析，最终找到发挥药效的体外成分群，以助于小叶榕水提物体外质量标准的制定。
　　5.在统一的色谱条件下，得到12批小叶榕叶有效部位体外色谱指纹图谱，并获得12批色谱数据，用SPSS统计学软件把分别将NO和TNF-α的药效数据与体外小叶榕叶水提物有效部位色谱指纹图谱中色谱峰峰面积值进行相关分析和回归分析，确定抗炎药效的产生与体外哪些成分密切相关，利用统计学软件，经谱效相关分析，结合提取分离得到的化学成分对3个药效成分群进行含量测定，以期在药效的基础上建立一个控制方法，完善咳特灵胶囊的质量控制。

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第一章 绪论

1.1 本课题的研究背景、意义和研究思路

1.2研究内容

1.3小叶榕的研究进展

1.4 中药药效物质基础研究现状

1.5中药质量标准研究现状

第二章 血清HPLC指纹图谱法研究小叶榕药效部位

2.1 材料

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

第三章 小叶榕叶水提物及不同极性部位对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞NO和TNF-α的影响

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四章 小叶榕叶抗炎有效部位化学成分分离及药效研究

4.1仪器与材料

4.2提取与分离

4.3 细胞培养

4.4 统计学分析

4.5 结果

4.6讨论

第五章 不同采收期小叶榕指纹图谱及其抗炎谱效关系研究

5.1试药与仪器

5.2方法

5.3结果与讨论

第六章 HPLC法同时测定小叶榕中三种成分的含量

6.1试药与仪器

6.2方法

6.3讨论与小结

第七章 总结与展望

7.1总结

7.2展望

[参考文献]

附图

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