VEGF在Lewis肺癌微转移灶形成中的作用及机制研究

摘要

肺癌是常见恶性肿瘤之一,严重着威胁人类的健康.早期诊断肺癌转移,尤其是肺癌亚临床转移和微转移(micrometastasis),对于提高肺癌的治愈率和生存率至关重要.目前有关肺癌微转移机理的研究日益受到重视,良好的实验模型是准确揭示癌细胞的侵袭、转移生长特性,进而阐明其机理的基础.绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是近年来发现的一种化学性能稳定的分子,己经在多种细胞中获得表达,用于定位蛋白及示踪细胞等研究.肿瘤血管生成及侵袭是肿瘤转移的必要条件.血管内皮细胞生长因子 (Vascular endothelial growth factor ,VEGF)是重要的血管生成因子,在人体多数细胞均有表达,通过其受体FLT和KDR诱导新生血管形成.sFLT是其可溶性受体,为VEGF功能抑制剂.近年来研究发现,VEGF在许多实体瘤中过量表达,与肿瘤血管生成、生长和转移密切相关.但VEGF与肿瘤微转移的关系尚未见报道.肿瘤转移是一系列复杂的事件,突破基底膜是肿瘤细胞进行浸润和转移的最初和最关键阶段,细胞外基质的降解是突破基底膜的必须环节.基质金属蛋白酶系统(matrix metalloproteinase,MMP)是组织基底膜和细胞外基质的主降解者,因而MMP在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用,其中以基质金属蛋白酶-2、9(MMP-2、9)的作用尤为重要.近来对血液性肿瘤和卵巢癌组织和等研究表明,VEGF可通过上调肿瘤细胞MMP-2、9的表达,继而促进肿瘤侵袭.VEGF在肺癌中有无此作用尚未见报道.该研究并以Lewis肺癌细胞(lewis lung carcinoma,LLC)为研究对象,利用基因克隆技术,构建绿色荧光蛋白标记的含鼠VEGF或sFLT全长序列的真核双表达载体,用脂质体法转染高转移Lewis肺癌细胞株,观察转染前后的细胞系对细胞生长、血管生成能力及基底膜侵袭能力的改变,并检测VEGF对金属蛋白酶MMP-2、MMP-9表达的影响;将转染后的细胞接种于C57BL/6J纯系小鼠,复制实验性和自发性微转移模型,观察VEGF对微转移形成的影响和相关因子表达的变化.最后还进一步从临床观察肺癌患者血清VEGF的水平与微转移的关系.主要结果如下:1. 以绿色荧光蛋白为报告基因,构建重组质粒转染鼠lewis肺癌细胞,利用肿瘤细胞侵袭实验、RT-PCR 、Westernblot等技术,观察转染后VEGF和sFLT在体外对lewis肺癌细胞株(LLC)侵袭和血管生成能力的影响.发现:1)利用基因克隆技术,成功构建了pEGFP-VEGF和pEGFP-sFLT真核双表达载体,并将两表达载体及pEGFP空载体转染Lewis肺癌细胞,并分别命名为LLC-VEGF、 LLC-sFLT 和LLC-mock,转染后的细胞在体外均能稳定表达绿色荧光.检测转染后的肿瘤细胞发现,VEGF及sFLT在体外对肿瘤细胞的生长无影响,提示VEGF可能是通过旁分泌途径作用于肿瘤细胞.2)肿瘤的转移与肿瘤血管生成及侵袭密切相关.血管内皮细胞粘附并向肿瘤移行才能实现肿瘤的血管生成.采用侵袭小室将肿瘤细胞与血管内皮细胞ECV304共培养,模拟体内癌细胞对血管内皮细胞的趋化作用.结果发现, LLC-mock 组、LLC-VEGF组和LLC-sFLT组迁移到膜背面的内皮细胞数分别是32±7.23个、97±10.26个和10±1.35个.即LLC-VEGF中过表达的VEGF能促进共培养的内皮细胞穿过基质,LLC-sFLT中高表达的sFLT能抑制共培养ECV304的迁移.在肿瘤细胞侵袭实验中,LLC-mock 组、LLC-VEGF组和LLC-sFLT组穿膜的细胞数分别为34±2.45个、75±15.11个和15±1.41个,统计学分析具有显著性差异(P<0.05).表明VEGF能促进肿瘤细胞的侵袭能力,sFLT能明显抑制肿瘤细胞的侵袭能力.上述结果提示VEGF均能增强肿瘤的血管生成能力及侵袭能力.3)MMP-2和MMP-9是主要的肿瘤侵袭因子,RT-PCR和Western Blot技术检测发现,VEGF可对其表达在转录及翻译水平都有上调作用,而sFLT可特异性抑制VEGF的作用.由此可见,VEGF可能是通过激活MMP-2、MMP-9的表达促进肿瘤细胞的侵袭能力,sFLT则通过阻断VEGF的功能,从而抑制MMP-2、MMP-9的表达,降低肿瘤细胞的侵袭能力.4)MMP-2、9以酶原形式分泌入细胞外基质,激活后才能发挥作用.利用明胶酶谱分析法检测MMP-2、9的活性时发现,与LLC-mock组相比,LLC-VEGF组MMP-2和MMP-9的含量均较高,而LLC-sFLT组较低(P<0.05).且MMP-2的含量较MMP-9高 (P<0.01).提示VEGF能增强MMP-2、9的活化,sFLT特异性地阻断这一效应.结果还显示,肿瘤细胞以活化MMP-2为主,提示MMP-2可能在肿瘤侵袭转移中起更为重要的作用.2. 采用小鼠成瘤实验,复制绿色荧光蛋白标记的实验性和自发性微转移模型,利用免疫组化、RT-PCR 和Western blot等技术,在体研究VEGF和sFLT对Lewis肺癌微转移灶形成及相关因子表达的影响.结果发现:1)实验性和自发性微转移模型分别在第2天和1周后检测到肺内绿色荧光蛋白示踪的微转移灶.实验性微转移灶在接种后第2、4、7天的平均直径分别为20μm、40μm和100μm,到接种后10天,平均直径迅速增大到500μm.2)在Lewis肺癌实验性和自发性微转移形成中,与LLC-mock组相比,LLC-VEGF组能明显增加微转移灶的数目和大小,LLC-sFLT组则显著抑制微转移灶的形成.提示VEGF能显著促进LLC-VEGF肿瘤细胞在肺内微转移灶的形成,sFLT能明显抑制LLC-sFLT肿瘤细胞在肺内种植.3)在自发性转移模型中,与LLC-mock移植瘤相比,LLC-VEGF组小鼠移植瘤微血管密度(MVD)显著增加.LLC-sFLT移植瘤的MVD比前两组都显著降低.提示VEGF能促进小鼠移植瘤的血管生成,sFLT则抑制小鼠移植瘤的血管生成.4)在自发性转移模型中,通过RT-PCR分析小鼠移植瘤组织中MMP-2、9的表达时发现,LLC-VEGF中高表达的VEGF能抑制MMP-2、 9的表达.LLC-sFLT则抑制MMP-2、9的表达;Western blot 检测蛋白水平变化得到相似的结果.对MMP-2、9的免疫组化染色结果也显示,LLC-VEGF小鼠移植瘤组织中MMP-2、9呈强阳性,LLC-sFLT小鼠移植瘤组织中该二因子呈弱阳性.说明高表达的VEGF促进移植瘤中MMP-2、MMP-9的表达,高表达的sFLT则抑制MMP-2、MMP-9的表达.5)在实验性转移模型和自发性转移模型中,随微转移灶的不断形成,血清VEGF的表达水平逐步升高(P<0.05).两种转移模型组间比较发现,LLC-VEGF细胞组中血清VEGF表达水平较其它两组高.将血清VEGF的表达与实验性转移模型中肺部微转移灶的大小进行相关性分析显示,两者呈正相关(r=0.9857, P<0.05).提示血清中VEGF的表达水平可以反映肺内微转移的情况.3. 采用免疫酶联技术和RT-PCR,分别检测130例临床非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清VEGF水平及外周血微转移标志物CK19mRNA的阳性率.分析血清VEGF水平与NSCLC微转移的关系.发现:1)血清VEGF的水平在Ⅰ-Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期随着临床分期的递增逐步升高(P<0.01).外周血CK19mRNA阳性率的检测有类似结果.2)VEGF的表达水平与CK19阳性率显著相关.CK19阳性者VEGF的表达显著增加.提示VEGF与肺癌的微转移相关.3)外周血CK19mRNA与血清VEGF能反映的肺癌转移情况.总之,该课题从体外侵袭与促血管形成能力的研究及在体内鼠微转移灶形成与相关因子的研究及临床肺癌患者血清VEGF水平的分析三个方面,阐述了VEGF促肺癌微转移形成的作用及其机制.结果表明VEGF能促进Lewis肺癌微转移灶的形成,其机制主要通过两条途径:一是作用血管内皮细胞,导致肿瘤血管生成,间接促进肿瘤微转移形成、发展;二是直接作用于肿瘤细胞,上调肿瘤细胞MMP-2、MMP-9的表达及活化,增强肿瘤细胞的侵袭能力,使肿瘤细胞通过溶解基底膜入血转移.并证明EGFP基因转染后癌细胞在体内、外可稳定表达绿色荧光蛋白,是肿瘤转移的体内实验研究提供可靠的模型.在临床研究中还发现,NSCLC血清VEGF水平和外周血CK19mRNA能反映肺癌的转移情况.

目录

英文缩写索引

前言

第一部分VEGF对Lewis肺癌侵袭及肿瘤血管生成能力影响的体外实验研究

第二部分VEGF在Lewis肺癌微转移灶形成中的作用及相关因子的表达

第三部分血清VEGF水平与非小细胞肺癌患者微转移的关系

全文结论

致谢

照片

参考文献

文献综述血管内皮生长因子及其受体与肺癌研究进展

博士在读期间发表文章