火器性周围神经损伤后神经元凋亡的特点及CIDE-B基因对神经元凋亡的影响

摘要

无论战时还是平时,火器性周围神经损伤都很常见.近年来尽管在神经修复方面取得长足的进展,但是神经损伤仍是困扰骨科的一个难题,神经修复后功能不能完全恢复,甚至有时效果并不理想,造成残疾.近年来的研究揭示,周围神经损伤后,相应中枢神经元发生程度不同的凋亡,与年龄、损伤部位的高低、致伤物的性质,损伤的能量高低有密切的关系.火器性周围神经损伤,神经元的凋亡程度更重,细胞数量减少更多.这是火器性周围神经损伤的功能恢复不理想的重要原因之一.凋亡(apoptosis)是细胞启动内在的程序,通过严密精确调节的蛋白级联水解方式最终引起细胞死亡的一种方式,在机体发育过程,抵御外来微生物,消除有害突变以及维持内环境的稳定等方面起重要作用.CIDE-B(Cell death-inducing DFF45-like effector ,CIDE)是凋亡信号通路中新近发现的促进凋亡的基因,在细胞凋亡中有重要的作用.神经元是高度分化的细胞,凋亡后胞体不能再生;周围神经只是神经元胞体的一部分,神经元的凋亡,丧失神经轴突再生的基础.如何减少神经元的凋亡,保护更多神经元免于凋亡,在外伤性周围神经修复方面具有重要的意义.对神经元保护,以往多集中在神经营养因子上,包括采用神经生长因子载体的基因治疗方法.而凋亡相关基因直接关乎神经元的凋亡,采用基因治疗的方法来抑制凋亡基因,以达到保护神经元的研究,国内外文献报道较少.如能抑制CIDE-B基因的表达,到达缓解或减轻神经元的凋亡,起到保护神经元的目的,则对神经修复后的功能恢复有极其重要的意义.为此,我们从以下方面进行了研究:1.火器性坐骨神经损伤后神经元凋亡的特点 探讨在火器性与切割性坐骨神经损伤两种不同致伤条件下,相应中枢神经元发生凋亡的不同特点,为对火器性周围神经损伤寻求一种新的治疗途径或思路.2.不同损伤条件下CIDE-B的变化与神经元凋亡的关系 初步探讨上述两种不同致伤条件下对CIDE-B表达的影响,及其与神经元凋亡之间的关系.3.CIDE-B的变化对神经元凋亡调控的体外研究 体外培养大鼠神经元细胞,通过干预其表达,了解其对相应神经元凋亡的影响.方法:1. 建立火器性坐骨神经断裂伤模型.以三角形弹片为致伤物,造成兔坐骨神经断裂伤模型,通过组织学,DNA凝胶电泳,TUNEL等方法,翔实地研究比较不同损伤神经元的凋亡规律.2. 提取脊髓总RNA,采用RT-PCR的方法检测CIDE-B的表达变化趋势.3. 采用原位杂交的方法分析脊髓神经元内CIDE-B的分布特征,变化规律.4. 提取脊髓总蛋白质,采用Western blotting方法研究蛋白的变化规律,揭示神经元凋亡与CIDE-B之间的内在联系.5. 建立原代脊髓神经元培养模型,采用机械损伤的方法诱导神经元的凋亡.设计18bpCIDE-B反义核酸,阻断神经元内mRNA的转录和翻译,通过流式细胞仪,台盼蓝活细胞拒染,TUNEL法,观察神经元凋亡情况.结果:1. 火器性坐骨神经断裂伤后,兔脊髓神经元发生明显的凋亡.损伤后6h后开始出现,1d、3d增加,7d达到凋亡高峰,持续到伤后2w开始下降,4w明显减少.神经切割伤组凋亡的时间出现较晚,数量较少.2. 火器性损伤神经损伤后,脊髓前角神经元的数量减少,2w、4w减少约11.2﹪,28.6﹪;切割伤组,伤后2w、4w时,脊髓前角神经元减少3.6﹪,11.8﹪.3. 在神经损伤后脊髓内,CIDE-B mRNA表达增强.火器性损伤组,增加的强度幅度较大,第1d开始增加,7d到达峰值,持续到2w,4w回落;切割伤组表达增加延迟,幅度也小.蛋白水平的变化与此相一致.4. 脊髓原代神经元培养,经过NF200kDa抗体鉴定,纯度越为80﹪.采用划痕法机械损伤诱导神经元凋亡,损伤后3d约有30﹪神经元发生凋亡.5. 体外神经元培养凋亡模型下,加入CIDE-B反义核酸,神经元凋亡数量下降到10﹪.而正义、随机核酸序列对神经元的凋亡没有明显的影响.结论:1. 凋亡特点火器性坐骨神经断裂伤后,脊髓神经元凋亡较震荡伤、切割伤严重,呈现发生早,持续时间长,神经元数量减少明显的特点,对神经的修复构成重大威胁.2. CIDE-B分布CIDE-B在体内的组织分布有组织特异性,主要在肝脏中表达.我们通过RT-PCR,原位杂交,Western blotting的方法首次证实该蛋白在脊髓内有明确的表达.3. CIDE-B表达规律无论火器性损伤还是切割伤,周围神经损伤后脊髓神经元CIDE-B在mRNA、蛋白水平的表达均增强,并且在火器性损伤组该基因改变更加明显.4. 调节CIDE-B对神经元凋亡的影响以反义核酸抑制CIDE-B的表达,能够显著减少损伤诱导的神经元凋亡.5. CIDE-B与凋亡的关系周围神经损伤后,脊髓内CIDE-B表达增强,诱导神经元凋亡; 阻断CIDE-B的表达,能有效抑制神经元的凋亡.

目录

文摘

英文文摘

英文缩写一览表

前 言

第一部分 火器性坐骨神经损伤后神经元凋亡的特点

第二部分 CIDE-B的变化与神经元凋亡的关系

第三部分 CIDE-B的变化对神经元凋亡调控的体外研究

全 文 小 结

致 谢

参 考 文 献

文献综述一

文献综述之二