AngⅡ及其1型受体拮抗剂对新生鼠心肌细胞凋亡影响及机制的实验研究

摘要

目的：细胞凋亡即程序性死亡，1972年由kerr等在研究肿瘤细胞形态时首次发现并报道，是细胞在基因严格控制下的一种细胞死亡形式。对器官和组织的正常发育、维持平衡是必不可少的。但是，过度凋亡将造成平衡的破坏导致机体发病。近年来，随着对凋亡研究的深入，人们认识到心肌细胞存在凋亡现象，是许多心脏疾病发病的细胞学基础。因此心肌细胞凋亡受到广泛的关注，成为生命科学中关注的热点。近年来的试验表明，心肌组织具有自身RAS，心肌细胞具有AngⅡ受体，分为1型、2型。目前已知，缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡与线粒体损伤有关。但对于AngⅡ参与心肌细胞凋亡作用及其机制却了解不甚透彻。本研究旨在通过体外原代培养心肌细胞技术，探讨AngⅡ对心肌细胞凋亡及早期转录调节因子c-fos、PCNA蛋白表达，iNOS、Bcl-2蛋白表达变化及caspases活性变化的作用。同时加入1型受体拮抗剂伊贝沙坦(irbesartan)与AngⅡ共同干预，观测其1型受体拮抗剂对心肌细胞凋亡率及上述指标的影响。 材料与方法：1.应用胰蛋白酶分步消化法进行体外Wistar大鼠新生鼠心肌细胞原代培养，采用特异性免疫组化染色方法鉴定所培养的心肌细胞。2.将培养96h的心肌细胞分为三组：对照组，采用无血清培养2h，6h，12h，24h；AngⅡ组，采用无血清含10-7mol/LAngⅡ培养基培养2h，6h，12h，24h，模拟心肌受损后局部自分泌、旁分泌作用；AugⅡ+AngⅡ1型受体拮抗剂irbesartan组，采用无血清含10-7mol/LAngⅡ，10-5mol/LIrbesartan培养基培养2h，6h，12h，24h。3.用免疫组化、TUNEL、荧光分光光度测定及RT-PCR等方法，分别观察不同时间点对照组、AngⅡ、AngⅡ+AngⅡ1型受体拮抗剂irbesartan组，原代培养心肌细胞凋亡小体数量，Bcl-2、iNOS、PCNA，c-Fos蛋白染色变化，caspase-9mRNA表达改变，caspase-3蛋白酶活性改变。探讨AngⅡ、AngⅡ和1型受体拮抗剂irbesartan对心肌细胞上述指标的影响。 结果：1.原代培养的新生鼠心肌细胞呈梭形、三角形及不规则形。其中，梭形细胞占培养细胞的大多数，胞体呈细长的梭形，胞质折光性强，搏动明显。细胞具有合抱生长趋势。采用特异性小鼠抗大鼠α-心肌肌动蛋白免疫组化染色，可见细胞浆中大量棕红色丝状阳性着色，胞核不着色。 2.TUNEL法检测心肌细胞凋亡小体数：在观察的24h对照组不同时间点均可见到少量心肌细胞凋亡小体。AngⅡ组心肌细胞于刺激2h与对照组相比无显著型差异(p＞0.05)。但随着时间的延长心肌细胞凋亡小体数量增多，以时间依赖方式进行。加入irbesartan与AngⅡ共同培养心肌细胞，凋亡小体数与相同时间点AngⅡ组相比下降，存在显著性差异(p＜0.01)，但与对照组相比也存在差异(P＜0.01)。 3.免疫组化染色：①Bcl-2蛋白染色阳性细胞于刺激2h，三组间相比无明显差异。但随着时间延长与对照组比较，AngⅡ组明显减少(P＜0.01)。AngⅡ+irbesartan组心肌细胞Bcl-2蛋白染色阳性较AngⅡ组增多(P＜0.01)，但与对照组相比亦存在差异(P＜0.01)。②c-fos蛋白表达在AngⅡ组2h时表达明显增强，6h开始下降，12h三组间几乎看不到有差异存在(P＞0.05)，AngⅡ+irbesartan组，2hc-fos表达受到明显抑制(P＜0.01)。③PCNA蛋白在对照组4个时间点均可见到少量表达。AngⅡ刺激2h时表达明显增强，持续到6h(p＜0.01)，之后表达逐步下降，12h三组间相比无明显差异(P＞0.05)。AngⅡ+irbesartan组，2hPCNA蛋白表达明显降低(p＜0.01)。④iNOS染色阳性细胞在AngⅡ刺激2h与对照组相比明显增多(P＜0.01)，6h达高峰，之后随时间延长逐步下降，12h三组间相比无显著性差异(P＞0.05)。AngⅡ+irbesartan组心肌细胞iNOS蛋白染色阳性细胞受到抑制(P＜0.01)。 4.荧光分光光度法测定caspase-3活性：在观察的24h内，AugⅡ组心肌细胞caspase-3活性与对照组相比，在刺激2h开始升高，6h达高峰，持续24h未下降(P＜0.01)。AngⅡ+irbesartan组，心肌细胞的caspase-3活性与AugⅡ组比较受到明显抑制(p＜0.01)。 5.用RT-PCR方法检测培养心肌细胞caspase-9mRNA表达：AugⅡ可上调心肌细胞caspase-9mRNA表达，与caspase-3活性相比两者表达变化趋势一致，在AugⅡ刺激2h开始增高，在观察的24h内持续处于高表达状态。AngⅡ+irbesartan组心肌细胞caspase-9mRNA表达受到抑制。 结论： 1.AngⅡ可时间依赖性地诱导Wistar新生鼠体外原代培养心肌细凋亡。 2.AugⅡ诱导Wistar新生鼠原代培养心肌细胞凋亡，其作用可能通过AT1介导，促凋亡作用被AT1拮抗剂irbesartan抑制。 3.AngⅡ诱导Wistar新生鼠原代培养心肌细胞凋亡，Bcl-2蛋白参与其凋亡调节过程。AugⅡ下调其蛋白表达，加入1型受体拮抗剂irbesartan蛋白表达上调。Bcl-2表达下调与促进凋亡发生有关。 4.AngⅡ诱导Wistar新生鼠原代培养心肌细胞凋亡以细胞内caspase激活依赖方式进行，caspase-9、caspase-3均激活。 5.AngⅡ诱导Wistar新生鼠原代培养心肌细胞凋亡早期促凋亡基因c-Fos，PCNA表达增强，促进心肌细胞凋亡。1型受体拮抗剂irbesartan抑制蛋白表达，随时间延长抑制了心肌细胞凋亡。 6.AngⅡ诱导Wistar新生鼠原代培养心肌细胞凋亡，其作用可能与早期心肌细胞iNOS表达增强，线粒体损伤有关。

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前言

第一部分Wistar大鼠新生鼠心肌细胞原代培养鉴定及心肌细胞凋亡模型建立

材料与方法

结果

第二部分AngⅡ及1型受体拮抗剂伊贝沙坦对原代培养新生鼠心肌细胞凋亡影响及相关机制的实验研究

材料与方法

结果

讨论

全文结论

致谢

照片1

照片2

照片3

参考文献

文献综述肾素-血管紧张素系统与心室重构

一、肾素-血管紧张素系统的病理生理学基础

二、肾素-血管紧张素与心室重构

参考文献

研究生期间发表的文章