BK通道α亚基酪氨酸磷酸化在休克VHR中的作用及其调控

摘要

血管低反应性(vasohyporesponsiveness,VHR)是创伤/休克等外科危重病人循环衰竭及机体死亡的重要原因,但机制不清.研究显示,失血性休克不仅可引起PTK活性的增强,且干预由PTK介导的蛋白酪氨酸磷酸化可恢复失血性休克及脓毒性休克动物阻力血管的反应性,提示蛋白酪氨酸磷酸化与休克血管低反应性形成有关,但究竟是何种蛋白的酪氨酸磷酸化在休克血管低反应性形成中起重要作用,尚未见报道.我们以前的工作显示,阻力血管BKCa通道的激活是休克后血管低反应性形成的重要原因.BK<,Ca>通道α亚基不仅具有与通道活性调制有关的酪氨酸磷酸化位点,且α亚基酪氨酸磷酸化也是调控血管平滑肌细胞BKCa通道开放的重要机制之一,提示BK<,Ca>通道α亚基可能是休克诱导蛋白酪氨酸磷酸化的下游信号靶蛋白.故该实验以大鼠失血性休克为模型,采用分子生物学、膜片钳及离体血管张力测定等手段,旨在阐明:(1)失血性休克对大鼠肠系膜上动脉平滑肌细胞BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化的影响及其调控;(2)BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化在休克血管BK<,Ca>通道活化及在血管低反应性形成中的作用;(3)NO/ET-1诱导休克血管低反应性形成与BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化的关系及信号途径.目的是为阐明失血性休克血管低反应性形成的分子机理以及寻求改善休克血管低反应性的新型药靶提供依据.主要研究结果及结论如下:1. 采用免疫沉淀(IP)及免疫杂交(WB)技术,发现失血性休克(30mmHg,2h及4h)可时间依赖性诱导大鼠肠系膜上动脉血管平滑肌细胞BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化的增强;采用原代培养的大鼠肠系膜上动脉血管平滑肌细胞,证实血管平滑肌细胞BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化与PTK/PTP介导的信号途径有关.2. 采用细胞吸附式膜片钳技术,发现失血性休克大鼠肠系膜上动脉血管平滑肌细胞BK<,Ca>通道被过度激活,表现为通道开放概率增加,单通道电导增加,通道慢关闭时间常数及平均关闭时间减小,通道开放对电压的敏感性显著增加;PTK抑制剂GST可明显抑制通道开放概率,延长通道关闭时间,降低通道开放对电压的敏感性,而PTP抑制剂矾酸钠可逆转GST的这一作用,提示由PTK介导的酪氨酸磷酸化与休克血管BK<,Ca>通道活化有关;进一步采用离体血管环张力实验证实,PTK抑制剂GST可在一定剂量范围内有效恢复休克大鼠肠系膜上动脉对NE的收缩反应性,而PTP抑制剂矾酸钠可使业已降低的休克血管反应性进一步降低,0.1mM TEA可部分抑制矾酸钠的这一作用(小于等于1mM的TEA被认为可特异性阻断BK<,Ca>通道),提示由PTK/PTP介导的BK<,Ca>通道酪氨酸磷酸化参与了休克血管低反应性降的形成.3. 采用L-精氨酸及内皮素(ET-1)诱导体外血管低反应性模型,进一步探讨由PTK/PTP介导的BK<,Ca>通道酪氨酸磷酸化在NO/ET-1诱导血管低反应性形成中的作用.结果显示,0.1mM TEA可部分恢复L-精氨酸及ET-1诱导的血管低反应性,提示L-精氨酸及ET-1诱导血管低反应性与BK<,Ca>通道有关;PTK抑制剂GST可部分恢复L-精氨酸及ET-1诱导的血管低反应性,而PTP抑制剂矾酸钠可使L-精氨酸及ET-1引起血管反应性进一步降低,0.1mM TEA可部分抑制矾酸钠的这一作用,提示BK<,Ca>通道酪氨酸磷酸化至少部分与L-精氨酸及ET-1引起血管收缩反应性降低有关.在原代培养的大鼠肠系膜上动脉平滑肌细胞,L-精氨酸可剂量依赖性诱导BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化增强,cGMP结构类似物8-Br-cGMP可引起与NO相似的BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化,且L-精氨酸诱导的BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化可被PKG抑制剂(KT-5823)部分阻断,提示NO诱导的BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化与cGMP/PKG依赖的信号途径有关;ET-1也可剂量依赖性诱导BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化增强,cAMP结构类似物8-Br-cAMP可引起与ET-1相似的BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化,且ET-1诱导的BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化可被PKA抑制剂(H-89)部分阻断,提示ET-1诱导的BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化与cAMP/PKA依赖的信号途径有关.总之,失血性休克不仅可诱导BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化的增强,且BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化是失血性休克血管BK<,Ca>通道激活及血管低反应性形成的重要原因之一,NO/ET-1参与诱导的失血性休克血管低反应性形成至少部分与BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化有关,cGMP/PKG及cAMP/PKA依赖的信号途径分别参与了NO/ET-1诱导的BK<,Ca>通道α亚基酪氨酸磷酸化的信号转导过程.

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