空间距离在胸腺基质细胞培训胸腺细胞中的关键作用

摘要

背景及目的：胸腺是培训胸腺细胞发育的首要场所，来源于骨髓的前T细胞进入胸腺环境中，从胸腺被膜下区，经胸腺皮质向皮质皮髓交界区、髓质移动，经一系列复杂的培训过程，包括增殖、受体基因重排、MHC限制的阳性选择、排除自身反应性和缺陷细胞的阴性选择、细胞表面分子和功能上的成熟等，确保了外周成熟T细胞可识别外源性抗原肽和自身MHC复合物(自身MHC限制性)，并消除自身反应性T细胞(自身耐受)。这个过程中每一步都是在胸腺的微环境中进行，胸腺微环境主要由胸腺基质细胞和细胞外基质组成，其中胸腺基质细胞是胸腺微环境中最重要的成分。胸腺基质细胞在胸腺中以三维立体构成网状支架结构，胸腺细胞与基质细胞在不同区域的相互作用对精密有序地完成了阳性选择和阴性选择起重要的作用。胸腺基质细胞在空间、时间上为胸腺细胞的培训提供了最适合的微环境，对胸腺细胞分化以及功能性亚群的形成有决定性的作用。 胸腺不仅在建立和塑造有功能的T细胞库中发挥作用，而且对诱导和维持自身耐受和移植耐受起关键作用。经胸腺途径诱导免疫耐受已进行了广泛研究，主要的机理是通过胸腺的选择作用，消除自身、同种、异种供体反应性T细胞，从而达到较稳定的免疫耐受。最近发现在胸腺基质细胞广泛地表达外周组织器官的组织特异性抗原，所以胸腺基质细胞被认为是外周组织器官的自身抗原库的镜子，在自身耐受和维持免疫自身稳定起着关键性作用。异种胸腺移植不仅可以重建有功能的细胞免疫功能，而且可以诱导供者特异性免疫耐受，但其面临的主要问题是宿主T细胞在异种胸腺内成熟后不能产生对宿主抗原足够的自身耐受，而发生了多器官的自身免疫损害，如甲状腺炎、泪腺炎、卵巢炎以及胃炎等，而同系或同种胸腺移植的受者未发生自身免疫综合征。我们以前将同系胸腺与异种胸腺充分混后再进行移植，既能诱导供体特异性的免疫耐受，又能防止自身免疫损害的发生。然而胸腺细胞在混合胸腺中是如何被训练的并不清楚；也不知道从骨髓来源的前T细胞进入混合胸腺后，是一个克隆的T细胞经历混合胸腺中的一个胸腺培训，还是要经历两个不同胸腺的共同培训?因此我们设计了将不同种类的两种胸腺分别移植在一个机体内的不同部位，并进行T细胞示踪实验，以阐明T细胞在成熟、分化过程中是一个连续不断的培训，还是在经过一个胸腺培训后进入外周，并能再次到另一处胸腺进行第二次培训?这些基本问题对我们理解T细胞发育和T细胞“再教育”具有重要意义。 方法 1.将不同类型胎胸腺移植到裸小鼠双肾包膜下，建立胸腺基质细胞培训T细胞的实验模型。实验分组：DB组(同系胸腺移植组，双肾包膜下移植BalB/C胎胸腺)；DC组(同种胸腺移植组，双肾包膜下移植C57BL/6胎胸腺)；DF组(异种胸腺移植组，双肾包膜下移植F344胎胸腺)；DBF组(同系异种胸腺混合移植组，双肾包膜下移植BalB/C+F344的混合胎胸腺)；DCF组(同种异种胸腺混合移植组，双肾包膜下移植C57BL/6+F344的混合胎胸腺)；LBRF组(同系、异种胸腺分开移植组，左肾包膜下移植BalB/C胎胸腺，右肾包膜下移植F344胎胸腺)；LCRF组(同种、异种胸腺分开移植组，左肾包膜下移植C57BL/6胎胸腺，右肾包膜下移植F344胎胸腺)。 2.利用流式细胞仪检测了胸腺移植4月后裸小鼠外周血中CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+CD25+T细胞，了解胸腺移植后受者裸小鼠T细胞的重建情况。 3.胸腺移植6月后裸小鼠受体的脾细胞体外进行ConA刺激和单向混合淋巴细胞反应，了解胸腺移植后裸小鼠受体重建T细胞的免疫功能。 4.观察移植胸腺存活情况与胸腺的体积大，利用组织学和免疫组织化学技术观察移植胸腺的结构以及受者骨髓源细胞在胸腺移植物内的分布情况。 5.胸腺移植4月后，裸小鼠受体进行皮肤移植实验，将正常BalB/C小鼠、C57BL/6小鼠、F344大鼠及SD大鼠的皮肤同时移植在受体裸小鼠背部，观测其皮肤移植物的存活情况。 6.用间接荧光染色的方法检测实验动物血清中有无针对宿主胃组织的自身抗体，用ELISA法测血清中抗DNA抗体，并记录各组动物因自身免疫性病疾的死亡率。 7.用51Cr同位素标记同系胸腺移植组和异种胸腺移植组的T细胞，分别再输注于LBRF组，48h和5d后，活杀实验动物，取各脏器进行同位素CPM测定，了解经一个胸腺发育成熟的T细胞是否可以再循环到另一个胸腺中进行再培训。 结果 1.各组胸腺移植物均存活良好，DB组、DC组、DF组、DBF组及DCF组两侧胸腺体积大小没有明显的差异，而LBRF组，右侧的异种F344胸腺显著较左侧的同系BALB/c胸腺体积小，LCRF组虽然两侧胸腺体积上没有明显差别，但较DB组、DC组、DF组、DBF组及DCF组的胸腺体积小。HE染色发现，移植胸腺具有正常的皮质和髓质结构。免疫组化染色显示，单纯异种胎胸腺移植中含有宿主MHCⅡ类抗原阳性细胞，主要位于髓质中，具有典型树突样外观。 2.各组胸腺移植后均能够有效重建受者裸小鼠外周血中的CD4+T，但外周血中CD3+CD8+T细胞明显低于免疫健全BALB/c小鼠，CD4+CD25+T细胞DB组、DF组、LBRF组比正常BALB/c小鼠低(P＜0.05)，其余各组与正常BALB/c小鼠没有显著差异。 3.各组胸腺移植后受者脾细胞对ConA及无关来源的SD鼠脾细胞刺激的应答均较强，而对自身BALB/c脾细胞刺激无显著反应，DC组、DF组、DBF组、DCF组分别对相应胸腺供者来源的C57BL/6、F344、BALB/c与F344、C57BL/6与F344的脾细胞没有增殖反应，而LBRF组、LCRF组分别对相应胸腺供者来源的脾细胞仍有反应。 4.皮肤移植实验显示，DB组：除对BalB/C皮肤不排斥外，对其它皮肤均排斥；DC组对宿主BalB/C皮肤和胸腺供者来源的C57BL/6皮肤耐受，而对无关的F344及SD皮肤排斥；DF组与DBF组对宿主BalB/C皮肤及胸腺供者来源的F344皮肤耐受，而对无关的C57BL/6皮肤及SD皮肤排斥；DCF组对宿主BalB/C皮肤及胸腺供者来源的F344、C57BL/6皮肤耐受，而对无关的SD皮肤排斥；LBRF组只对宿主BalB/C皮肤耐受，而对胸腺供者来源的F344皮肤延迟排斥，对无关的C57BL/6皮肤及SD皮肤排斥；LCRF组只对宿主BalB/C皮肤耐受，而对胸腺供者来源的F344及C57BL/6皮肤延迟排斥，对无关的SD皮肤排斥。 5.单纯异种胸腺组(DF组)因自身免疫性病疾死亡率最高(70％)，其次是不同种类胸腺在不同部位分开移植的LBRF组(45.5％)与LCRF组(33.3％)。各组的肾脏、肝脏、心脏以及肺脏等器官均未发现明显的病理改变和淋巴细胞浸润。但DF组、LBRF组及LCRF组胃组织有炎症性损伤和淋巴细胞浸润，其它组胃组织均未见明显的炎性损害和淋巴细胞浸润。DF组、LBRF组、LCRF组血清中有针对宿主胃组织的自身抗体和抗DNA抗体的相对滴度显著增高，提示DF组、LBRF组、LCRF组有自身免疫性损害。 6.标记51Cr的同系胸腺发育和异种胸腺发育的T细胞，分别再输注于同系、异种胸腺分开移植的LBRF组后，48h和5d后，主要分布在肝脾部位，也在两种不同胸腺中分布，按每g组织内含的51Cr标记T细胞时发现，最高的是胸腺，其次是脾脏与肝脏。 结论 1.实验成功建立了不同类型胸腺移植模型，通过胸腺移植可有效重建受者裸小鼠功能性胸腺细胞。 2.同系或同种胸腺与异种胸腺混合移植可诱导胸腺供者来源的免疫耐受，不发生自身免疫性疾病；而同系或同种胸腺与异种胸腺分开移植于同一裸鼠的不同部位后不能诱导对供者来源的移植物完全耐受，也不能防止自身免疫性疾病的发生，说明空间距离在胸腺基质细胞培训胸腺细胞中起关键作用。 3.胸腺混合移植诱导受者对供者的完全耐受表明，一个克隆的T细胞肯定是在一次的程序化培训中同时经两种胸腺共同培训或经提呈有另一个胸腺组织抗原的胸腺基质细胞的培训；胸腺分开移植诱导受者对供者的不完全耐受，表明从一个胸腺发育的T细胞只有部分会再经过另一个胸腺的培训。 4.经一种胸腺培训的外周成熟T细胞可以返回自身的胸腺，也可以返回另一种胸腺中进行再培训，返回胸腺的成熟T细胞可能增强阴性选择，可能与免疫耐受有关。胸腺基质细胞对未成熟的前T细胞培训比对成熟T细胞的培训更有效。 5.克隆消除的中枢耐受是混合胸腺移植诱导供者免疫耐受和防止自身免疫性疾病的主要以机理为主，而外周细胞调节不是混合胸腺移植诱导及维持耐受的关键机制。 6.在同系或同种胸腺与异种胸腺分开移植的模型中，两种胸腺体积大小不一，可能与一种胸腺培训的T细胞对另一种胸腺发生部分排斥反应有关。

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参考文献

文献综述一胸腺细胞的分化发育研究进展

文献综述二异种胸腺移植诱导异种移植免疫耐受研究进展

在读期间发表的论文