生物人工肝聚砜膜中空纤维反应器的初步研究

摘要

反应器是生物人工肝(Bioartificialliver，BAL)系统的核心部分，其性能直接关系到人工肝支持的效率和效果。由于同种肝细胞、肝细胞株和肝干细胞分别存在来源困难、安全隐患和研究欠深入等问题，故培养异种肝细胞的中空纤维反应器成为BAL研究的主要方向。聚砜膜具有良好的热稳定性、耐氧化性、机械加工性，但是其对肝细胞的粘附性及对肝细胞功能发挥的影响尚不清楚。生物反应器膜材料的性能、适合于BAL的细胞培养方式、中空纤维反应器的性能都是BAL研究中需要解决的问题。 本实验观察原代乳猪肝细胞在聚砜膜界面生长的形态，检测聚砜膜生物界面对乳猪肝细胞的合成功能和生物转化功能的影响，以评价聚砜膜是否为良好的反应器膜材料；应用磁力搅动法进行乳猪肝细胞多细胞聚集体的培养，观察多细胞聚集体的形态和功能，探索适合于BAL的细胞培养方式；采用聚砜膜中空纤维反应器构建生物反应器实验系统，观察乳猪肝细胞多细胞聚集体接种到反应器的生长情况和功能变化及该系统对重型肝炎病人血浆(Severehepatitisplasma，SHP)的影响，以评价聚砜膜中空纤维反应器的性能。实验方法和结果如下： 一、乳猪肝细胞在聚砜膜生物界面生长的研究 观察乳猪肝细胞在聚砜膜生物界面的生长情况，检测其白蛋白合成、尿素合成、氯化铵清除、酶漏出量的情况，并与乳猪肝细胞在聚苯乙烯界面生长的情况进行对比分析。形态观察显示，在聚砜膜界面生长的乳猪肝细胞形态规整，大小均一，呈球型粘附、铺展，形成多细胞聚集体。在培养过程中，聚砜膜上生长的肝细胞白蛋白合成率、尿素合成率和氨清除率均优于聚苯乙烯界面生长的乳猪肝细胞，聚砜膜和聚苯乙烯两组的乳猪肝细胞LDH和AST漏出量在低水平波动，两组肝细胞的LDH、AST含量无显著性差异。 二、磁力搅动法培养乳猪肝细胞多细胞聚集体的观察 将新分离的乳猪肝细胞悬液放入平底烧瓶中，利用磁力搅拌器和搅拌子，进行多细胞聚集体的磁力搅动培养，计算多细胞聚集体的形成率、贴壁率，观察多细胞聚集体的形态，检测多细胞聚集体的白蛋白合成量、尿素合成量、酶漏出量等指标。在培养过程中，多细胞聚集体形成率随时间的延长而上升，贴壁率随时间的延长而下降，6h，多细胞聚集体的形成率为73.5±10.5％，贴壁率在78.6±6.9％。多细胞聚集体多为10～20个乳猪肝细胞组成，直径在100～200μm之间，形态规则，轮廓清晰，超微结构基本正常。在整个实验过程中，多细胞聚集体能保持较好的白蛋白合成率、尿素合成率。本实验中多细胞聚集体培养液上清的AST和LDH漏出量的水平较高，尤其以前2h为最。 三、聚砜膜中空纤维反应器性能的评价 利用聚砜膜中空纤维反应器和Cello培养循环式人工毛细管培养装置构建反应器实验系统，将磁力搅动法培养所得的多细胞聚集体接种到反应器外腔，观察反应器中培养的多细胞聚集体的白蛋白合成量、尿素合成量、酶漏出量及对SHP的影响。在整个实验时间里，反应器外腔所留标本测得肝细胞的白蛋白合成率随时间的延长而升高，而反应器内腔所留标本未测出猪白蛋白。尿素合成率随时间的延长而升高，AST浓度先升后降，LDH浓度则持续上升，在48～72h期间显著增高。在整个实验时间里，SHP的氨浓度持续降低，2h较之0h有显著性差异，其后血氨浓度下降趋势减缓；总胆红素浓度持续降低，6h的总胆红素浓度接近0h的2/3；凝血酶原时间持续降低，总降低量达5s左右；TNF-α、TGF-β1含量持续降低，0～2h内变化最大，2h较之0h有显著性差异，其后下降趋势减缓。 以上结果提示：1、聚砜膜具有较好的生物相容性，乳猪肝细胞能以多细胞聚集体的形式在其表面生长，同聚苯乙烯界面相比，其分泌、合成、转化、解毒功能均显著提高，肝细胞膜无明显损伤。聚砜膜可以作为良好的BAL反应器膜材料。2、磁力搅动多细胞聚集体培养法，能在6h内培养形成数量较多、形态结构较好、大小合适的多细胞聚集体，其超微结构基本正常，能保持较好的肝细胞功能，但仍有部分肝细胞的细胞膜受损。磁力搅动法可望成为较好的BAL细胞培养方式。3、聚砜膜中空纤维反应器能为肝细胞提供良好的生长代谢环境，乳猪肝细胞的多细胞聚集体在聚砜膜中空纤维反应器培养过程中，能保持较好的分泌、合成能力。该反应器也能为肝衰竭患者血液与肝细胞相互作用、进行物质交换提供理想的场所，可以有效清除SHP中的小分子毒性物质，补充有益成分，降低细胞因子水平。聚砜膜中空纤维反应器可以成功构建BAL实验系统。

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摘要

前言

第一部分乳猪肝细胞在聚砜膜生物界面生长的研究

第二部分磁力搅动法培养乳猪肝细胞多细胞聚集体的观察

第三部分聚砜膜中空纤维反应器性能的评价

全文结论

致谢

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参考文献

文献综述生物人工肝研究进展