胆囊收缩素在胆管癌神经周围浸润转移中的作用及其分子机制

摘要

本文从以下四个方面就CCK对胆管癌恶性生物学行为的影响及其分子机制，以及胆管癌神经周围浸润过程中CCK的作用进行了初步研究： 1、培养QBC939胆管癌细胞的形态学观察、CCK的影响及其脱落细胞的种植转移特性的研究。结果显示：胆管癌细胞传代接种后，光镜下可见细胞贴壁、生长、分裂，形成圆形或椭圆形巢状结构；继续培养，可见培养液中出现悬浮细胞并逐渐增多。扫描电镜下可见，培养细胞相互接触后，接触面的细小绒毛减少，变为较粗的纤毛样或“残枝样”突起，而位于多个细胞间的细胞随着与其它细胞及培养面实际接触面积的减少，逐渐变圆，最后整个细胞逐渐脱离培养面，成为脱落细胞，漂浮于培养液之中，凋亡小体少见。加入CCK8s后，可见细胞密度、圆形深染细胞较对照组增多，提示CCK8s能够促进细胞增殖；扫描电镜可见，CCK8s组细胞集落多不规则，细胞表面较平滑，绒毛较粗短，细胞间绒毛较对照组明显为少。CCK8s对细胞的形态变化，以及细胞间的联系的影响，提示其可能会对细胞的粘附、转移特性具有重要作用。对细胞在悬浮状态保存、接种并计数的结果表明，脱落的胆管癌细胞并未凋零或死亡，且能够在悬浮状态下仍然保持较长时间的活力，遇到合适的培养面，它可以再次贴附，恢复原来的形态，并且分裂增殖。这些结果提示，在临床上对于脱落的肿瘤细胞，重新粘附可能是更为困难的步骤。在体外培养条件下，存在有脱落—漂浮—种植—生长现象，这种现象可能与体内肿瘤具有相同的“细胞脱落—种植转移”机制。2、胆囊收缩素对人胆管癌细胞粘附、运动及侵袭能力的影响的研究。结果发现：CCK8s能够呈浓度依赖方式影响QBC939细胞的粘附、运动和侵袭能力，生理浓度的CCK8s即能够明显降低QBC939细胞的粘附、运动和侵袭能力；而CCK1及CCK2受体的拮抗剂L18和L60均能够明显减弱CCK8s抑制瘤细胞粘附的作用，提示CCK1及CCK2受体对于QBC939细胞的粘附均具有重要作用。本研究还发现，外源性的CCK8s与QBC939细胞的运动和侵袭能力呈正相关，L18，L60能够明显减弱CCK8s的作用，尤以L60明显。说明CCK2受体在影响QBC939细胞的运动、侵袭能力方面可能具有较强的作用。 3、胆囊收缩素对人胆管癌细胞侵袭能力的影响的分子机制的实验研究。结果发现：CCK8s能够能够明显降低胆管癌细胞QBC939的E-cadmRNA的表达，其CT值相差1.72(3.29倍)个循环。CCK8s还能够增加MMP-2、MMP-9mRNA的表达，其中MMP-2增加CT值2.04个循环(4.11倍)，MMP-9增加CT值3.55个循环(11.71倍)。WesternBlot结果表明：CCK8s增加胆管癌细胞QBC939的E-cad的蛋白表达以及基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的蛋白表达，这与定量PCR结果相一致。提示CCK8s能够通过降低肿瘤细胞的粘附，增加胆管癌细胞降解周围基质的能力，促进胆管癌细胞的浸润转移。对胆管癌细胞/Matrigel培养后的Masson染色结果也显示，肿瘤细胞周围可见明显的基质融解环，显示胆管癌细胞能够通过分泌各种蛋白酶降解人工基质。 4、胆囊收缩素对人胆管癌细胞神经周围浸润影响的实验研究。研究结果显示，在QBC939细胞与DRG/神经细胞共培养模型中，QBC939细胞能够融解并穿过神经突起周围的基质成分，靠近神经纤维并贴附其生长，进一步癌细胞可分裂增殖形成包绕神经纤维的细胞团，提示QBC939细胞对神经纤维具有亲嗜性，QBC939对神经纤维的浸润为一主动的、连续的过程。研究结果还显示，CCK8s加入DRG/神经—肿瘤细胞培养体系中后，能够明显增加肿瘤细胞对神经突起的浸润，而L18，L60均能够明显减弱CCK8s的促进效应，但二者之间差异不明显。提示CCK能够促进肿瘤细胞的神经侵袭过程，该作用能够被其特异的阻断剂所抑制。实验结果还显示，Matrigel能够较好的满足小鼠DRG/神经细胞培养的要求，该体系较好的复制了肿瘤细胞穿过细胞基质，浸润神经纤维的过程，能够直观的观察肿瘤细胞/神经纤维的相互作用，为进一步深入研究肿瘤细胞/神经相互作用提供了较好的模型。 上述结果显示，胆管癌细胞具有抗脱落凋亡特性，其对神经纤维的浸润为一主动的、连续的过程。CCK能够影响QBC939细胞的形态结构，降低胆管癌细胞的粘附能力，促进胆管癌细胞的增殖，运动和浸润能力，进而促进胆管癌细胞神经周围浸润过程，其机制与CCK能够下调胆管癌细胞的E-cad基因、增强MMP-2、MMP-9的基因表达有关。

目录

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摘要

前 言

第一部分胆管癌脱落细胞的形态学观察、CCK8s的影响及其种植转移特性

实验一胆管癌脱落细胞的形态学观察及CCK8s的影响

材料和方法

结 果

实验二胆管癌脱落细胞的种植转移特性

材料和方法

结 果

讨 论

第二部分胆囊收缩素对人胆管癌细胞粘附、运动及侵袭能力的影响

材料和方法

结 果

讨 论

第三部分胆囊收缩素对胆管癌细胞侵袭能力的影响分子机制的实验研究

材料和方法

结 果

讨 论

第四部分胆囊收缩素对QBC939细胞神经周围浸润影响的实验研究

材料和方法

结 果

讨 论

全文结论

致谢

照 片

参考文献

文献综述一CCK/Gastrin及其受体与肿瘤的关系

1胆囊收缩素的分子结构与类型

2CCK的受体、拮抗剂及其分子结构

3CCK受体的基因结构

4CCK受体激活的信号转导与功能研究

5CCK受体的分布和生理作用

6CCK受体的亚型及其作用

7CCK受体与胃肠道肿瘤

8CCK受体与胆胰肿瘤

9CCK受体与肿瘤研究展望

参考文献

文献综述二胆管癌及其神经周围浸润的研究

攻读学位期间发表的论文