ERK1/2、p38MAPK在鱼藤酮中毒诱导的神经细胞凋亡和iNOS表达中的作用研究

摘要

鱼藤酮是由温、热带植物毛鱼藤(Derris)根茎中提取天然化合物，有灭虫、除螨作用，被广泛用于农业蔬果、庭院花草、豢养宠物的虫害控制。新近研究结果显示，长期接触该类化合物可导致中枢多巴胺神经元损伤，流行病学研究认为环境中鱼藤酮与帕金森氏症的病因有一定联系。探讨ERK1/2、p38MAPK信号通路在鱼藤酮中毒所诱导的神经细胞凋亡和iNOS表达中的作用机制，以提供线粒体抑制类环境污染物在神经退变性疾病发病的相关实验依据，对相关疾病的临床研究及其防治具有重要的指导意义。 方法：①SD大鼠分别连续皮下注射1/3、1/6、1/12LD50剂量的鱼藤酮42天，建立鱼藤酮长期作用大鼠损伤模型，以Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力变化、光镜和扫描电镜观察大鼠海马组织病理损伤，TUNEL法检测海马神经细胞凋亡及生化法检测海马组织AChE活性；②采用RT-PCR、Westernblot和免疫组织化学检测ERK1/2和p38MAPKmRNA和蛋白表达变化，应用光学比色法分析鱼藤酮中毒后大鼠海马组织NO、NOS、MDA、SOD和GSH-Px水平的变化；③采用离体PC12细胞鱼藤酮中毒模型，以流式细胞仪技术、TUNEL法检测PC12细胞凋亡，Westernblot检测ERK1/2、p38MAPK蛋白表达，荧光分光光度法分析Caspase-3活力、EMSA检测转录因子AP-1、CREB转录活性；④应用ERK1/2、p38MAPK抑制剂PD98059和SB203850调控MAPK的活性，观察PC12细胞凋亡、NO含量和NOS活性、iNOS基因和蛋白表达变化及转录因子AP-1活性的变化。 结果：①SD大鼠经不同剂量的鱼藤酮长期作用42天，可导致大鼠体重增加减缓和海马组织结构受损，并能明显诱导海马神经细胞凋亡，且齿状回阳性细胞数和着色深度明显强于CA1和CA3区；鱼藤酮长期作用对海马组织AChE活性无明显影响，Morris水迷宫检测结果显示，鱼藤酮中毒各实验组逃逸潜伏期、穿越平台次数、航行轨迹和搜索平台所在象限时间等观察指标与正常对照无明显差异，提示鱼藤酮长期作用对大鼠Morris水迷宫学习记忆能力无明显影响。②鱼藤酮长期作用后大鼠海马组织磷酸化ERK1/2和p38MAPK蛋白和mRNA表达呈不同程度的上调，低剂量中毒组上调程度不明显，变化幅度未超过20％，高剂量鱼藤酮中毒组上述两种激酶蛋白和mRNA变化均超过正常对照的50％，p38MAPK变化更加明显，磷酸化p38MAPK蛋白和mRNA分别上调至正常的202.91％和189.59％；TUNEL法及免疫组化显示鱼藤酮长期作用可致海马ERK1/2和p38MAPK磷酸化增强，以齿状回阳性细胞最多，着色最深；鱼藤酮长期作用后大鼠海马组织NO、MDA、NOS水平出现显著升高，SOD、GSH-PX活性明显降低，1.2mg/kg鱼藤酮中毒组海马SOD和GSH-PX活性分别比正常对照降低40.47％和37.43％。③鱼藤酮中毒可导致PC12细胞出现不同程度的损伤，表现为细胞外观形态改变、细胞存活率下降、细胞凋亡率和Caspase-3活性增加、线粒体膜电位降低；免疫组织化学和免疫印迹实验结果显示鱼藤酮中毒可导致PC12细胞磷酸化ERK1/2和p38MAPK蛋白表达增强，以p38MAPK增加尤为明显；鱼藤酮中毒可导致PC12细胞NO、MDA含量升高，NOS活性升高，SOD和GSH-PX活性降低；鱼藤酮中毒后PC12细胞转录因子AP-1与DNA的结合活性增加，而CREB变化不明显。④经ERK1/2抑制剂PD98059预处理，PC12细胞凋亡率无明显变化，经p38MAPK抑制剂SB203850预处理后，PC12细胞凋亡率明显降低，较未处理组降低43.00％，但仍显著高于正常对照；联合运用PD98059和SB203850预处理，PC12细胞凋亡率与单独使用SB203850预处理基本一致；单独应用PD98059或SB203850预处理，PC12细胞NO含量、NOS活性、iNOS基因和蛋白表达、转录因子AP-1活性较无抑制剂中毒组均出现不同程度的下降，以SB203850预处理组变化更为明显；联合应用PD98059和SB203850预处理，则上述降低趋势更加明显，但各组仍高于正常对照组水平。 结论：①鱼藤酮长期作用可导致大鼠体重增加减缓和海马组织结构受损，并能明显诱导海马神经细胞凋亡，但在所提供的实验条件下，鱼藤酮长期作用对大鼠Morris水迷宫学习记忆能力无明显影响。②鱼藤酮长期作用可导致大鼠海马组织ERK1/2和p38MAPK基因和蛋白表达增强，NO和自由基代谢失衡。③鱼藤酮中毒可导致PC12细胞凋亡率增加、Caspase-3活性增加和线粒体膜电位降低、ERK1/2和p38MAPK蛋白磷酸化增强、NO和自由基代谢失衡及AP-1转录活性增加。④p38MAPK信号通路的激活可激活AP-1的DNA结合活性，促进鱼藤酮中毒诱导的PC12细胞凋亡和iNOS的表达，除上述两条MAPK信号通路外，还起其它信号通路参与了鱼藤酮中毒神经细胞转录因子AP-1激活的调控。 综上所述，鱼藤酮长期作用可导致海马组织ERK1/2和p38MAPK信号通路的激活，p38MAPK信号通路的激活可激活AP-1的DNA结合活性，促进鱼藤酮中毒诱导的PC12细胞凋亡和iNOS的表达，在鱼藤酮长期作用所致的海马神经细胞损伤机制中起了十分重要的作用。

目录

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英文缩写一览表

摘要

前 言

第一部分鱼藤酮长期作用对大鼠Morris水迷宫学习记忆和海马神经元超微结构的影响

材料与方法

结 果

讨论

小 结

第二部分鱼藤酮长期作用对大鼠海马ERK1/2、p38MAPK信号通路的影响特点

材料与方法

结 果

讨论

小 结

第三部分鱼藤酮中毒对PC12细胞的毒性效应和ERK1/2、p38MAPK信号系统的影响特点

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第四部分调控ERK1/2、p38MAPK信号系统对鱼藤酮中毒诱导的PC12细胞凋亡和iNOS表达的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文小结

致 谢

照 片1

照 片2

照 片3

照 片4

照 片5

照 片6

参考文献

文献综述一MAPK信号级联及其在神经系统损伤中的作用

文献综述二 NO与神经细胞凋亡及相关神经系统疾病研究进展

博士在读期间发表的论文