成年豚鼠小肠壁内Cajal细胞再生及细胞网络再形成实验研究

摘要

Caial细胞(InterstitialcellsofCajal，ICCs)作为一种特殊的间质细胞，以细胞网络的形式分布于整个胃肠道。近二十余年，国内外学者通过对胃肠壁内ICCs的形态特征、超微结构、起源及生理功能等的一系列研究表明：ICCs具有产生自发性电慢波、参与神经信息传递等功能，在调节胃肠道平滑肌运动中发挥重要作用。 动物实验发现：胃肠壁内ICCs减少、细胞网络缺如的大鼠和小鼠，胃肠运动自主节律性消失，呈扩张性肠麻痹状态，胃和肠的内容物反流，提示ICCs减少及其细胞网络完整性的破坏可能与上述现象的发生有关。临床可见胃肠道手术后患者常常出现一过性肠麻痹和胃肠蠕动运动功能消失等假性肠梗阻症状，推测可能与ICCs细胞网络断裂和手术部位ICCs的表型(phenotype)发生急性变化(不能被其特异性标志物所染色)，丧失正常功能有关。近年临床研究亦发现ICCs与一些胃肠运动功能障碍性疾病：例如贲门失弛缓症、慢传输型便秘、假性肠梗阻、先天性巨结肠等密切相关。尽管上述疾病的发生机制尚不清楚，但均有一个共同的特点：病变部位胃肠壁内ICCs数量呈不同程度减少，甚至缺如，ICCs彼此间及其与平滑肌之间不能形成完整的细胞网络。但因对上述疾病的发病机理及ICCs减少、细胞网络完整性被破坏的原因等尚不清楚，一直是临床治疗的难题。 设想如果能够阐明成年动物消化管壁内ICCs损伤丢失后，是否通过再生、细胞突起生长延长、重新形成细胞网络的调控机制，势必可为临床相关疾病的治疗及腹部外科术后胃肠运动功能的恢复提供有益的思路。因此，本实验利用外科手术的方法，模拟术后胃肠运动功能障碍，制作小肠壁内ICCs受损及细胞网络完整性被破坏的动物模型，结合免疫组化染色、双重标记技术、透射电镜观察等方法，动态分析小肠半横断吻合术后ICCs的变化。该模型不仅能够使我们了解小肠术后ICCs的变化，同时也有助于阐明成年动物肠壁内ICCs是否具有分裂增殖能力、随着时间的经过ICCs的突起能否通过生长延长重新形成细胞网络，及其平滑肌细胞和神经对此过程的影响等问题，为治疗胃肠运动功能障碍性疾病开辟新的思路和方法。 主要结果如下：根据吻合断端的特点，将其分为3区域：Ⅰ区位于肠壁横断末端，平滑肌层因回缩而稍增厚，该区突出于肠腔；Ⅱ区是紧靠Ⅰ区正常侧的平滑肌层，是吻合部位，由于缝线张力的牵拉作用使该区肠壁肌层变薄；Ⅲ区是Ⅰ区和Ⅱ区浆膜面与吻合中线间的区域。 一、术后吻合部位ICCs动态观察术后10和5天的KIT免疫细胞化学染色无明显差异，在Ⅰ区和Ⅱ区可见IC-MY(或)和IC-DMP断裂，ICCs丢失，且Ⅱ区靠近正常肠壁部位的IC-MY和IC-DMP较正常稀疏。Ⅲ区则充填了大量的结缔组织，未见到ICCs。术后30天在Ⅰ区和Ⅱ区ICCs缺失的区域以及Ⅲ区都可见到少量的ICCs，其形态特点为：核椭圆、胞质较少、突起短而少，且排列无规律。术后50天，在Ⅰ区和Ⅱ区这些ICCs逐渐增多，并趋向于聚集在肌间神经丛和深肌丛部位，此时ICCs的突起向Ⅲ区延伸，Ⅲ区可见更多的ICCs出现。术后70天，Ⅰ区和Ⅱ区的ICCs重新形成IC-MY和IC-DMP细胞网络，基本恢复正常的分布模式，但细胞密度较正常高，在该区域的纵行平滑肌层的浆膜面也可见ICCs。Ⅲ区的ICCs进一步增多，分布仍不规律，但可见细胞突起变长，出现2～3级分支。术后90天，Ⅰ区和Ⅱ区ICCs分布已经恢复正常，而Ⅲ区的ICCs继续增加。至术后150天左右，吻合口部位头尾端的肠壁结构和延续性基本恢复正常，同时Ⅲ区的ICCs分别与正常肠壁IC-MY和IC-DMP网络相延续，基本恢复正常分布模式。 二、再生ICCs的数量、分布及形态BrdU标记为红色荧光，而KIT蛋白的标记为绿色荧光；在假手术组和术后5天组的肠粘膜上皮和吻合口部位，可见大量呈红色荧光的BrdU阳性细胞核，说明BrdU已被具有分裂能力的细胞摄取，但均未见双标阳性细胞。术后10天左右，在吻合口两侧的断端，可见1～3个绿色的细胞质包绕红色的细胞核的双标阳性细胞，细胞主要分布在距离吻合口断端约1mm以内。至术后30天前后，吻合口附近的双标阳性细胞数量增加，平均约6～10个，分布在距离吻合口断端3mm以内。再生ICCs在术后50天进一步增加，平均14～18个，分布范围亦扩大到距离吻合口断端4.5mm左右。新生的ICCs与正常ICCs形态相似，位于IC-MY的双标阳性细胞有2～3个突起，并有2～3级分支，胞核椭圆形，胞质较少；而位于IC-DMP的ICCs胞质较丰富，且再生的ICCs中58％～74％分布在IC-DMP。 三、影响Cajal细胞再生的可能因素手术后环行和纵行平滑肌的生长有所不同。术后30天左右，纵行平滑肌开始生长，向对侧延伸，50天左右，纵行平滑肌已穿过吻合口与对侧相延续；而环行平滑肌呈现为局部膨大，约150天前后，才恢复结构的延续性。SCF免疫细胞化学染色发现，平滑肌呈SCF强阳性，神经为弱阳性，而粘膜、粘膜下层以及结缔组织均为阴性。α-SMA/SCF双标显示，环行和纵行平滑肌，粘膜下肌层和血管平滑肌等均为SCF阳性；KIT/SCF双标显示可见再生的ICCs主要分布在平滑肌细胞之间，或平滑肌束周围。NOS/SCF染色显示，在吻合部位可见大量的NOS神经纤维分布，神经元和神经纤维为SCF弱阳性。

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前 言

总材料与方法

结 果

讨论

结 论

参考文献

全文总结

致谢

照 片1

照 片2

照 片3

照 片4

文献综述Cajal细胞自主节律的产生机制研究进展

攻读硕士期间发表论文