血管生成抑制剂去甲二氢愈创木酸（NDGA）对大鼠胚胎及卵巢功能影响的初步研究

摘要

去甲二氢愈创木酸(Nordihydroguaiareticacid，NDGA)是美洲常见灌木L.tridentata中的主要化学成份，在西南美洲和墨西哥北部地区的印第安人有用这种植物的茎和叶制成的草药来治疗外伤、解痉、消炎止痛和驱除寄生虫的传统。NDGA也可以人工合成，作为一种强抗氧化剂用于食品防腐。 国内外学者对NDGA进行了多年研究，发现其具有多种生物学活性，其中最具代表性的是其能抑制脂氧化酶的活性。另外还发现NDGA能降低Ⅱ型糖尿病模型的大鼠血糖水平、抑制海马神经元中β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导的Ca2+的积聚、抑制泌乳素刺激的酪蛋白的分泌、干扰雌二醇和睾酮与人性激素结合蛋白(SHBP)的结合等。目前对NDGA研究得最深入的是其抗肿瘤的作用。大多数学者认为，肿瘤内出现新生的毛细血管是肿瘤获得进一步生长并发生转移的必备条件，而NDGA作为血管生成抑制剂(angiogenesisinhibitor)，能通过抑制新生血管的内皮细胞增殖，降低内皮细胞生长因子受体2(Flk-1/KDR)的表达水平来抑制血管生成(angiogenesis)。Wilson等发现NDGA有诱导胶质瘤细胞分化的作用，从此将NDGA作为一种癌分化诱导剂的研究进入了一个全新领域，国内卞修武等近年来也发现NDGA能有效抑制恶性胶质瘤细胞的增殖，诱导其分化和凋亡，给肿瘤的治疗带来了新的方向。 而在女性生殖系统中，血管生成作用在子宫内膜周期性增殖、卵泡的生长、排卵、黄体的发育及妊娠期子宫内膜的蜕膜化形成等过程中都相当活跃。这为研究NDGA的抗血管生成作用提供了天然模型。 本研究通过HE染色、免疫组化染色、图像分析及电化学发光免疫分析等方法和手段，采用反复皮下注射(s.c.)、单剂量皮下注射和宫腔内插管灌注NDGA的方式，观察子宫和卵巢的形态学改变和内皮细胞生长因子(VEGF)、增殖细胞核抗原(PCNA)及第八因子相关抗原(FⅧRAg)抗体在蜕膜中的表达以及性激素水平的变化，探讨NDGA作为血管生成抑制剂对SD大鼠卵巢功能和早期胚胎血管生成的影响及其作用机制。 主要方法和结果如下：一、NDGA对大鼠卵巢功能的影响选动情周期规律的雌性大鼠分别隔日皮下注射NDGA和PBS溶液，连续20天后部分与同种雄鼠合笼交配；部分处死取子宫和卵巢标本，作HE染色及PCNA和FⅧRAg抗体免疫组化染色，并检测注射NDGA前后的血清性激素。结果：1.NDGA组的雌鼠不能与雄鼠成功交配而怀孕，阴道涂片提示动物处于动情周期中的动情间期； 2.HE染色见NDGA组卵巢中多数的成熟黄体体积都偏小，闭锁卵泡增多，子宫内膜腺体小而少，与对照组比较非常显著的统计学差异(p＜0.01)； 3.免疫组化染色见子宫内膜基质细胞、腺体上皮细胞和血管内皮细胞PCNA抗体多为弱阳性，与对照组比较有非常显著的统计学差异(p＜0.01)；FⅧRAg抗体表达弱，微血管密度(MVD)计数低，与对照组比较有显著性差异(p＜0.05)； 4.NDGA组雌二醇E2分泌呈低水平(p＜0.01)，孕酮P在总体上呈低水平，动情期和动情间期组稍高于动情前期和后期组，与注射前比较有非常显著的统计学差异(p＜0.01)；促卵泡素FSH都呈高水平(p＜0.05)；促黄体生成素LH的波动不规则，与用药前比较没有统计学上的差异(p＞0.05)。 二、NDGA皮下注射对大鼠早期胚胎血管生成的影响选妊娠第1天(E1)和第7天(E7)的雌鼠按30mg/kg剂量一次皮下注射NDGA和PBS溶液，于E9时取子宫标本，观察胚胎和新生鼠发育情况，作HE染色及VEGF、PCNA和FⅧRAg抗体免疫组化染色，检测血清孕酮。结果：1.对胚胎的影响：E1时注射者，NDGA组妊娠胚胎数减少，胚胎直径较小(p＜0.01)。E7注射，胚胎数目无明显变化(p＞0.05)，但胚胎直径较对照组小(p＜0.01)。 2.对新生鼠的影响：NGDA组每窝产崽数较对照组少(p＜0.05)；而各鼠崽的平均体重与对照组比较无明显差异(p＞0.05)。 3.血清孕酮含量：NDGA组与PBS组无统计学差异(p＞0.05)。 4.免疫组化染色和图像分析：NDGA组蜕膜中VEGF和PCNA抗体表达减弱，阳性染色细胞区域的平均光密度(AOD)值和MVD计数与对照组比都有显著性差异(p＜0.01)。 三、NDGA宫腔灌注对大鼠早期胚胎血管生成的影响选妊娠E1和E7的雌鼠按30mg/kg剂量一次宫腔插管灌注NDGA和PBS溶液，于E9时取子宫标本，观察胚胎的发育情况，并于足月时行剖宫产取出胎鼠，观察胎鼠发育情况。作HE染色及VEGF、PCNA和FⅧRAg抗体免疫组化染色，检测血清孕酮。结果：1.对胚胎的影响：1)E1灌注者，NDGA组和对照组注药侧胚胎数目都减少，但二者比较无统计学差异(p＞0.05)；NDGA侧胚胎的平均直径明显小于对侧和对照组的灌注侧，分别比较有显著的统计学差异(p＜0.05)； 2)E7灌注NDGA者，注药侧胚胎数无明显减少(p＞0.05)，但胚胎的平均直径与对照组比较有显著性差异(p＜0.05)。 3)胚胎直径上E1灌注NDGA侧与E7比较有显著性差异(p＜0.01)。 2.对足月胎鼠的影响：1)E1灌注NDGA者，注药侧胎鼠数与对侧比较有显著性差异(p＜0.05)和对照组灌注侧比较则没有统计学差异(p＞0.05)； 2)E7灌注NDGA者，注药侧胎鼠数无明显减少，与对侧和对照组比较均无统计学差异(p＞0.05)； 3)E1和E7灌注者，灌注NDGA侧的胎鼠重量与对侧和对照组比都无统计学差异(p＞0.05)。 3.血清孕酮值：NDGA组与PBS组比较均无统计学差异(p＞0.05)。 4.免疫组化染色和图像分析：NDGA组蜕膜中VEGF和PCNA抗体表达减弱，阳性染色细胞区域的AOD值和MVD计数与对照各组比都有显著性差异(p＜0.01)。 结论：1.NDGA能通过抑制卵巢和子宫内膜中微血管内皮细胞的增殖来抑制血管生成作用，长时间用NDGA可以干扰雌鼠卵巢激素的分泌，使动物的动情周期发生紊乱； 2.NDGA经宫腔灌注和皮下注射都能抑制蜕膜中VEGF的表达，抑制微血管生成和细胞增殖，能影响大鼠胚胎生长发育，但对孕酮的分泌没有直接影响。

目录

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前 言

第一部分NDGA对大鼠卵巢功能的影响

材料与方法

结 果

讨 论

第二部分NDGA皮下注射对大鼠早期胚胎血管生成的影响

材料与方法

结 果

讨 论

第三部分NDGA宫腔灌注对大鼠早期胚胎血管生成的影响

材料与方法

结 果

讨 论

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述 去甲二氢愈创木酸生物学作用的研究进展