三羟异黄酮与化疗药物联合作用对HER-2/neu高表达人乳腺癌细胞株MDA-MB-453生长的影响及其机制研究

摘要

乳腺癌目前已经成为第一位威胁女性健康的恶性肿瘤，其中原癌基因HER-2/neu过度表达类型的乳腺癌约占30％。此类乳腺癌对传统化疗药物存在明显耐药，常导致化疗失败。HER-2/neu编码的蛋白为跨膜型人表皮生长因子受体家族成员，具有内在的酪氨酸蛋白激酶(proteintyrosinekinase，PTK)活性，有报道HER-2/neu高表达乳腺癌的化疗抗性与HER-2/neuPTK激活介导的信号转导通路有关。 Herceptin(又名trastuzumab)，人源化的抗HER-2/neu单克隆抗体已于1998年通过美国FDA批准上市进入临床应用，其主要作用机制是通过降低HER-2/neu蛋白表达来发挥作用。目前Herceptin和化疗药物联合应用已作为HER-2/neu过度表达乳腺癌的首选治疗方案。但是Herceptin价格昂贵，一个疗程花费需数十万元，并且对心脏有一定的毒副作用，因此寻求价格低廉、毒副作用小的Herceptin的替代药物具有十分重要意义。 三羟异黄酮(Genistein,GEN)作为大豆中的一种主要异黄酮成分，已有大量流行病学和实验研究证据表明其具有抗肿瘤作用，尤其是对乳腺癌防治可能具有重要意义。传统的亚洲饮食结构中富含大豆，从某种程度上可部分解释亚洲妇女乳腺癌发病率相对较低的原因。Genistein是一种重要的天然植物雌激素，对人体无明显毒副作用，其结构与雌二醇非常相似，具有模拟和拮抗雌激素、抑制PTK活性等重要药理作用。有关genistein的抗癌作用研究近年来备受国内外学者重视，尽管已有大量研究资料表明genistein是一种潜在的乳腺癌化学防治药物，且前期我们实验室研究发现genistein能抑制HER-2/neu的PTK活性，但其能否增强HER-2/neu高表达乳腺癌化疗的敏感性尚不清楚。 基于以上分析，本研究以体外培养的HER-2/neu过度表达人乳腺癌细胞MDA-MB-453为研究对象，首先通过MTT实验、流式细胞分析、细胞形态学观察和Annexin-V-FITC/PI双标记法等方法，观察genistein和化疗药物紫杉醇(Paclitaxel，PTX)、阿霉素(Doxorubicin，DOX)联合应用对MDA-MB-453细胞生长的影响，初步明确genistein对HER-2/neu过度表达乳腺癌体外化疗是否具有增敏作用；然后通过蛋白免疫印迹分析、免疫细胞化学等方法，研究genistein对MDA-MB-453细胞Akt、p-Akt、CyclinB1、CDK1蛋白表达的影响，进而阐明genistein影响HER-2/neu过度表达乳腺癌化疗的主要机制。 主要研究结果和结论如下： 1.GEN、DOX、PTX单独作用时，均可抑制MDA-MB-453细胞生长，且随药物剂量增加，抑制率也增加，呈剂量依赖性关系。GEN与DOX联合处理时，10、20μmol/L的GEN与DOX的联合效应为相加效应，q值在0.85～1.15之间，而40μmol/LGEN与DOX的联合效应为协同效应，q＞1.15。GEN与PTX联合处理时，各浓度的GEN与PTX的联合效应为拮抗效应，q＜0.85。 2.GEN、DOX、PTX均可影响MDA-MB-453细胞周期进程。0.5μmol/LDOX或0.8μmol/LPTX单独作用48h后，均引起MDA-MB-453细胞阻滞于G2/M期；40μmol/LGEN单独作用48h后，引起MDA-MB-453细胞阻滞于G0/G1期。GEN与DOX或PTX联合作用48h后，GEN削弱DOX或PTX对MDA-MB-453细胞G2/M期的阻滞作用。 3.倒置显微镜下观察发现，对照组乳腺癌细胞大多为多角形，细胞生长旺盛，呈高折射率。药物作用后细胞生长受抑制，细胞逐渐变圆、变小，折光率增强，附壁疏松，少量细胞悬浮，随时间延长漂浮细胞逐渐增多。经Wright-Giemsa染色后，在光镜下观察，对照组细胞核着色均匀，呈淡蓝色或蓝色，未见凋亡小体。处理组胞质中颗粒增多并可见细胞膜出泡，核质比例增大，核变形、皱缩，核染色质浓聚或呈月牙形边聚，出现凋亡小体。 4.流式细胞仪检测结果显示，溶剂对照组细胞凋亡率为4.52％，0.5μmol/LDOX单独处理组细胞凋亡率为12.36％(P＞0.05)，当DOX合用40μmol/LGEN时，其凋亡率达35.26％(P＜0.05)，说明GEN可增强DOX诱导MDA-MB-453细胞凋亡的作用。0.8μmol/LPTX单独处理组细胞凋亡率为20.90％(P＜0.05)，当PTX合用40μmol/LGEN时，其凋亡率下降为10.50％(P＜0.05)，说明GEN可拮抗PTX诱导MDA-MB-453细胞凋亡的作用。 5.GEN对MDA-MB-453细胞HER-2/neu蛋白表达无影响，对总Akt蛋白水平亦无影响，但可降低活性形式的p-Akt蛋白水平；同时PI3K特异抑制剂wortmannin也能降低MDA-MB-453细胞p-Akt蛋白水平，并增强DOX、PTX抑制MDA-MB-453细胞生长的作用。提示抗凋亡因子Akt活化在MDA-MB-453细胞抵抗DOX诱导凋亡中具有重要意义，且其激活依赖于PI3K的活化，而GEN可通过抑制HER-2/neu的PTK活性，阻断其介导的PI3K/Akt激活，增加DOX诱导MDA-MB-453细胞凋亡的敏感性。 6.GEN降低MDA-MB-453细胞CyclinB1蛋白表达水平，并拮抗PTX增强MDA-MB-453细胞CyclinB1蛋白表达，削弱PTX对G2/M期的阻滞作用，进而降低PTX体外化疗MDA-MB-453细胞的敏感性。 综上所述，HER-2/PI3K/Akt信号途径在HER-2/neu高表达乳腺癌MDA-MB-453细胞抵抗阿霉素化疗诱导细胞凋亡中起重要作用，三羟异黄酮通过抑制HER-2/neu的PTK活性，阻断HER-2/PI3K/Akt信号途径增敏阿霉素体外化疗MDA-MB-453细胞的效果；CyclinB1蛋白表达水平增加，发生G2/M期阻滞对紫杉醇诱导MDA-MB-453细胞凋亡具有重要意义，三羟异黄酮拮抗紫杉醇增加CyclinB1蛋白表达水平的作用，并削弱紫杉醇对MDA-MB-453细胞G2/M期的阻滞作用，进而降低紫杉醇体外化疗乳腺癌MDA-MB-453细胞的效果。提示三羟异黄酮联合化疗药物治疗HER-2/neu高表达乳腺癌时，应结合化疗药物自身的特点来考虑。

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摘要

前言

实验方案与技术路线

第一部分三羟异黄酮与化疗药物联合作用对HER-2/neu高表达人乳腺癌细胞株MDA-MB-453生长的影响

第二部分三羟异酮影响化疗药物诱导HER-2/neu高表达人乳腺癌细胞株MDA-MB-453凋亡敏感性的机制研究

全文结论

致谢

照片

参考文献

文献综述一大豆异黄酮防治妇女雌激素缺乏相关疾病的研究进展

文献综述二PI-3K/Akt信号途径与HER-2neu高表达乳腺癌化疗抗性的关系

攻读硕士学位期间发表的文章